Bacillus cereus

Отличительные особенности бацилл: представлены крупными прямыми палочками, положительно окрашивающимися по Граму, способны образовывать споры в аэробных условиях, единственным патогенным для человека видом выступает Bacillus anthracis (палочка сибирской язвы), некоторые условно-патогенные виды также способны вызывать пищевые интоксикации и госпитальные инфекции. Бациллы выделяют из почвы, пресной и морской воды, а также с растений. Они могут расти в интервале температур от 5 до 75 °С, а их выживанию в экстремальных условиях способствует спорообразование. Госпитальные поражения (пневмонии, септицемии, эндокардиты, менингиты и др.) вызывают В. subtilis, В. cereus и В. megaterium (рис. 4, см. цветную вклейку), В. alvei, В. laterosporus, В. pumilus, В. thuringiensis и В. sphaericus. Поражения регистрируют сравнительно редко, а их развитию у человека способствуют широкая распространённость бактерий и высокая устойчивость их спор к различным воздействиям.

Bacillus cereus – это повсеместно встречающиеся грамположительные, спорообразующие, подвижные палочки.

Систематическое положение микроорганизма.

Семейство

Fungi impcrfecti Eubacteriales Bacillaceae Bacillus subtilis

Они вызывают у людей желудочные заболевания (диарею и др.), а также септицемию, эндокардит, поражения центральной нервной системы. Заболевание, как правило, непродолжительное и прекращается без какого-либо лечения, однако зарегистрированы также и единичные смертельные случаи. Отчетность о пищевых отравлениях Bacillus cereus не регистрируется, поскольку отмечено относительно низкое число случаев, вызванных ими заболеваний (до 1% от общего числа). Частота заболеваний географически варьирует. Так, в отдельных странах они составляют менее 1% всех пищевых отравлений, в то время как в других – более 30%. Bacillus сereus выделяется из продуктов сравнительно часто, что делает этот вид бактерий значимым индикаторным тест-организмом для пищевой промышленности. Пищевые продукты, подверженные наиболее частому риску заражения – это мясные и молочные продукты, овощи, супы, специи и, в особенности, продукты детского питания. Почти все штаммы Bacillus сereus продуцируют токсины. Цитотоксические энтеротоксины продуцируют почти 95% изолятов Bacillus сereus. Из них негемолитический энтеротоксин (NHE) продуцируют более чем 90% штаммов, а гемолизин BL (HBL) около 55% исследованных штаммов. Полагают, что HBL и NHE образуются в кишечнике больного после употребления продуктов, загрязненных вегетативными клетками или спорами Bacillus сereus. В дополнение к этим двум токсинам некоторые штаммы Bacillus сereus продуцируют термостабильный рвотный энтеротоксин (ЕТЕ). Предполагается, что вначале энтеротоксин ЕТЕ накапливается в пище, причем чаще в продуктах, содержащих крахмал, таких как рис и макаронные изделия. По указанным причинам контроль названных продуктов на содержание энтеротоксинов с применением надежных ускоренных методов тестирования становится все более актуальным.

Патогенность, масштабы заболевания

Bacillus cereus - Dextrose casein-peptone agar

Bacillus cereus является условно патогенным микроорганизмом, котрый вызывает у человека спорадические пищевые отравления. Bacillus cereus повсеместно распространен в природеЭтиологическая роль Bacillus cereus при пищевых отравлениях первоначально изучена и описана Наugе в 1950 г. Источником пищевых отравлений, обусловленных Bacillus cereus, сперва считали кулинарные изделия, содержащие картофельный крахмал. Затем были описаны вспышки аналогичных отравлений, обусловленные растительными, мясными, рыбными и другими пищевыми продуктами. Наиболее быстро Bacillus cereus размножается в измельченных продуктах (фарш, котлеты, колбаса, кремы). В сырье допускается не более 100 клеток/г, в консервах присутствие Bacillus cereus не допускается. В стерилизованных мясных консервах при соблюдении установленных технологических режимов, клетки этой бактерии отсутствуют. Когда в консервированном продукте остаются жизнеспособные споры, то в условиях хранения консервов при 20 о С может отмечаться размножение возбудителя. На поверхности продукта при этом появляется налет серого цвета, изменяются его запах и консистенция. Bacillus cereus способен вызывать диарейный синдром также у животных, птиц и насекомых по истечении 6-18 ч после поедания ими зараженного корма. Первично это обусловлено несколькими видами токсинов (NHE, НBL, bc-D-ENT), содержащимися в инфицированной пище, а впоследствии – размножением бактерии в кишечнике. Этот комплекс токсинов Bacillus cereus вызывает цитотоксический эффект и секрецию жидкости в кишечнике. При постановке биопробы на мышах у животных в месте введения наблюдается некроз кожи, а в последующем гибель.

Исследование воздействия ампициллина на морфологические и механические свойства клеток Escherichia coli и Bacillus cereus с использованием метода атомно-силовой микроскопии

Д. Г ДЕРЯБИН, А. С. ВАСИЛЬЧЕНКО, А. Н. НИКИЯН

Оренбургский государственный университет

Investigation of Ampicillin Effect on Morphological and Mechanical Properties of Escherichia coli and Bacillus cereus Cells with Atomic Force Microscopy

D. G. DERYABIN, A. S. VASILCHENKO, A. N. NIKIYAN Orenburg State University, Orenburg

Методом атомно-силовой микроскопии изучено влияние суббактериостатических концентраций ампициллина на морфологические и механические свойства клеток грамотрицательного (Escherichia coli K12 TG1) и грамположительного (Bacillus cereus IP5832) микроорганизмов. Показана выраженная гетерогенность бактериальных популяций по характеру реагирования на воздействие антибиотика. Общим моментом являлось увеличение размера клеток, что может быть обусловлено действием внутреннего осмотического давления на снизившую свою прочность клеточную стенку. Помимо этого в популяции E.coli обнаружены аномально удлинённые клетки с признаками нарушения септирования, а также происходящие от них структуры, утратившие жидкую фракцию цитоплазматического содержимого. В свою очередь у B.cereus действие внутреннего осмотического давления преимущественно вело к увеличению поперечного сечения клетки, изменяя её форму от палочки к сфере, что сопровождалось выраженным нарушением структурированности поверхности с освобождением фрагментов пептидогликана в окружающую среду. В качестве причины наблюдаемых особенностей реагирования E.coli K12 TG1 и B.cereus IP5832 на воздействие ампициллина названы различия в строении их клеточных стенок, в том числе обусловленные особенностями синтеза и трёхмерной организации пептидогликана.

Ключевые слова: ампициллин, Escherichia coli, Bacillus cereus, атомно-силовая микроскопия, морфологические и механические характеристики бактериальной клетки.

The effect of subbacteriostatic concentrations of ampicillin on morphological and mechanical properties of gramnegative and grampositive cells of Escherichia coli K12 TG1 and Bacillus cereus IP 5832 respectively was studied with atomic force microscopy. Significant heterogeneity of the bacterial populations was shown by the character of the response to the antibiotic effect. The common feature was increase of the cell size likely due to the effect of the inner osmotic pressure on the lowered cell wall strength. In the E.coli population there were besides observed anomalous elongated cells with signs of septation disorder, as well as their structurs, lacking the cytoplasmic liquid fraction. In the B.cereus the inner osmotic pressure mainly enlarged the cell cross section, changing the cell shape from rod to sphere, that was accompanied by significant impairment of the surface structure with liberation of the peptidoglycane fragments to the medium. The particular features of the E.coli K12 TG1 and B.cereus IP 5832 respond to the ampicillin effect were attributed to the differences in the structure of their cell wall, also due to specific properties of the peptidoglycane synthesis and three-dimensional organization.

Key words: ampicillin. Escherichia coli, Bacillius cereus, atomic force microscopy bacterial, cell morphological and mechanical characteristics.

Введение

термальные клетки-мишени . В качестве одного из подобный методов в настоящее время рассматривается атомно-силовая микроскопия (АСМ), разработанная Г. Биннигом и К. Гербе-ром в 1986 г. и основанная на оценке взаимодействия упругого зонда (кантилевера) с поверхностью исследуемого образца . По сравнению с растровой электронной микроскопией АСМ имеет ряд значимых преимуществ, заключающихся в более высоком разрешении, возможнос-

Совершенствование традиционных и создание новых препаратов с антимикробной активностью требует использования широкого арсенала методов, позволяющих комплексно оценивать механизмы и последствия их воздействия на бак-

E-mail: [email protected]

ти получения представлений об истинных трёхмерных характеристиках объекта, нетребовательности к созданию вакуума и нанесению на образец металлического покрытия . Последнее обстоятельство определило уникальную возможность использования АСМ для изучения морфологических и механических свойств клеток про- и эукариотов из живого состояния.

Сказанное объясняет высокую востребованность АСМ для визуализации последствий воздействия различных препаратов на модельные микроорганизмы . При этом в ряде подобных работ в качестве «препарата сравнения» используется антибиотик ампициллин, по отношению к которому оцениваются эффекты вновь создаваемых веществ и соединений . Кроме того, самостоятельное значение имеет и детализация механизмов биологической активности самого ампициллина, по-прежнему занимающего заметное место в арсенале современной антибио-тикотерапии .

В этой связи целью настоящей работы явилось экспериментальное изучение воздействия ампициллина на морфологические и механические свойства клеток модельных грамотрицатель-ного (Escherichia coli) и грамположительного (Bacillus cereus) микроорганизмов, реализованное с использованием метода атомно-силовой микроскопии.

Материал и методы

При проведении работы использованы музейные штаммы Escherichia coli K12 TG1 и Bacillus cereus IP 5832. В зависимости от этапа эксперимента культивирование данных микроорганизмов проводилось на LB-агаре или LB-бульоне («Sigma-Aldrich», США) при 37°С.

При определении суббактериостатических концентраций ампициллина (ОАО «Биохимик», Россия) его навески в количестве 5 мг растворяли в 5 мл LB-бульона, из которого готовили серии двукратных разведений с содержанием антибиотика от 1 мг/мл до 20 пг/мл. В качестве контроля использовали идентичную среду культивирования без действующего агента. Исходные культуры E.coli K12 TG1 и B.cereus IP 5832 выращенные в течение 18-24 ч на LB-агаре суспендировали до оптической плотности 0,5 ед. при 620 нм. Полученной суспензией в объёме 5 мкл инокулировали 2,5 мл LB-бульона с различным содержанием ампициллина, инкубировали в течение 18-24 часов, после чего оценивали наличие роста визуально, а также по поглощению при 620 нм. Определённые подобным образом суббактериостатические концентраций ампициллина составили для E.coli K12 TG1 7,8 мкг/мл, а для B.cereus IP 5832 0,1 нг/мл.

Выращенные в присутствии ампициллина (опыт) и в его отсутствии (контроль) микроорганизмы отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в дистиллированной воде, после чего в объёме 10 мкл наносили на свежий скол слюды и высушивали в течение 24 ч при относительной влажности 95% и температуре 20-22°С в соответствии с ранее предложенной процедурой . Полученные образцы исследовали методом атомно-силовой микроскопии в контактном режиме с использованием мульти-ми-кроскопа SMM-2000 (ЗАО «КПД», Россия). В процессе сканирования использовались кантилеверы MSCT-AUNM («Park Scientific Instruments», США) с жесткостью балки 0,01 Н/м и ра-

диусом кривизны иглы порядка 15-20 нм. Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа. Исследование упругих свойств бактериальных клеток проводили путём анализа силовых кривых, описывающих зависимость изгиба балки кантилевера от расстояния между иглой зонда и поверхностью исследуемого образца. На данной основе рассчитывали величину силы, необходимую для деформации образца на заданную величину и характеризующую упругость объекта .

Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием модульной программы «Attestat», работающей в среде MS Excel.

Результаты и обсуждение

Использование атомно-силовой микроскопии позволило представить каждый из исследуемых объектов в виде трёхмерных сканов, содержащих информацию о длине, ширине и высоте бактериальных клеток, на основании чего дополнительно были рассчитаны площадь их сечения, а также объём подобных объектов. Помимо этого с высоким разрешением был оценен показатель шероховатости (профиль) поверхности бактериальных клеток, а также их упруго-механические свойства.

При АСМ интактных клеток E.coli K12 TG1 (рис. 1, а) последние обнаруживались как палочковидные объекты с закругленными концами, размерные характеристики которых составляли 2,46±0,34 мкм по длине, 1,24+0,27 мкм по ширине и 0,20+0,03 мкм по высоте. Соответственно рассчитанные на этой основе величины площади сечения и объёма бактериальных клеток равнялись 0,20+0,07 мкм2 и 0,48+0,16 мкм3. На некоторых сканах были визуализированы отходящие от поверхности клеток ворсинки и одиночные пери-трихиально расположенные жгутики. Измеренный профиль бактериальной поверхности (рис. 1, б) позволил зафиксировать величины шероховатости интактных клеток E.coli K12 TG1 на уровне 2,26+0,59 нм, а измененные величины их упругости характеризовались величиной 2,74+1,79 МПа, примерно соответствующей таковой, ранее установленной для клеток других грамотрица-тельных микроорганизмов .

В свою очередь интактные клетки B.cereus IP 5832 визуализировались как расположенные цепочками палочки с «обрубленными» концами (рис. 1, в), при морфометрическом анализе имеющие длину 4,40+0,94 мкм, ширину 1,53+0,39 мкм и высоту 0,47+0,06 мкм. Соответственно рассчитанные на этой основе величины площади их сечения и объёма равнялись 0,57+0,17 мкм2 и 2,50+0,86 мкм3. У единичных клеток обнаруживались по 1-2 полярно расположенных жгутика. Сканирование бактериальной поверхности (рис. 1, г) показало значения шероховатости, равные 2,71+0,75 нм, а исследование механических свойств клеток оценивало их упругость величи-

Рис. 1. Фазовые АСМ-изображения (а, в) и профили поверхностей (б, г) интактных клеток E.coli K12 TG1 (а, б) и B.cereus IP 5832 (в, г).

ной 2,54±0,78 МПа. В целом, по сравнению с E.coliK12 TGI, клетки B.cereus IP 5832 могли быть охарактеризованы как значительно более крупные объекты, имеющие несколько большую шероховатость, но меньшую упругость поверхности при механическом воздействии. При этом в основе выявленных различий лежит принадлежность B.cereus IP 5832 к отделу Firmicutes, классу Bacilli, порядку Bacilliales с характерным для грамполо-жительных эубактерий строением поверхностных клеточных структур, а также родовые, видовые и штаммовые особенности исследуемого микроорганизма.

Результаты исследования морфологических и механических свойств клеток E.coli K12 TG1, выросших в присутствии суббактериостатической концентрации ампициллина, констатировали выраженную гетерогенность бактериальной по-

пуляции по характеру её реагирования на подобное воздействие (рис. 2, а). Так, 92,04±4,3% клеток (в таблице обозначены как объекты 1-го типа) в значительной степени сохраняли свою морфологию по сравнению с интактными микроорганизмами, оказываясь несколько более тонкими (1,00±0,34 мкм; р<0,01), но удлинёнными до 3,40±0,72 мкм (р<0,01) образованиями, одновременно несколько увеличивающими свой объём до 0,54±0,23 мкм3. При этом возможной причиной подобных изменений могло являться «растягивающее» действие внутреннего осмотического давления на снизившую свою ригидность клеточную стенку. Этим же может объясняться и более низкая остаточная упругость инкубированных в контакте с ампициллином клеток Е.соИ К12 Т01, в данном случае характеризуемая величиной 2,03±1,54 МПа. В то же время шерховатость по-

Рис. 2. Фазовые АСМ-изображения (а-г) и профили поверхностей (д, е) клеток E.coli K12 TG1 (а, б, д) и B.cereus IP 5832 (в, г, е), инкубированных в контакте с суббактериостатическими концентрациями ампициллина.

добных объектов существенно не отличалась от контрольных величин, что связано с зависимостью этого параметра от свойств наружной мембраны исследуемого грамотрицательного микроорганизма, не имеющей молекулярных мишеней для воздействия ампициллина.

На этом фоне до 7,96+4,3% визуализированных объектов было представлено аномально удлиненными образованиями с признаками нарушения септирования (в таблице обозначены как объекты 2-го типа). В данном случае при относительной неизменности ширины и высоты, их длина (18,52+8,66 мкм) и объём (3,88+2,18 мкм3) в 6,7-7,7 раз превышали таковые у интактных клеток (^<0,01). Природа же зарегистрированных изменений может быть обусловлена высоким сродством ампициллина к пенициллинсвязыва-ющему белку (англ. - РВР) 3 типа, контролирующему процесс формирования межклеточных перегородок при делении .

Наконец, ещё одним проявлением гетерогенности популяции Е.еоН К12 Т01 по её чувствительности к воздействию ампициллина явились обнаруживаемые на единичных сканах клеточные структуры с признаками утраты жидкой фракции цитоплазматического содержимого (рис. 2, б; в таблице обозначены как объекты 3-го типа). Последние визуализировались как заполнен-

ные гранулярным материалом уплощённые образования, по своей высоте (0,08+0,03 мкм; /><0,01) и площади сечения (0,09+0,03 мкм2; ^<0,01) более чем в два раза уступающие сохранившим свою целостность бактериальным клеткам. Их дополнительными особенностями также являлись значительно более высокие показатели шероховатости (13,32+4,85 нм; ^<0,01), а также характеризуемая модулем Юнга жесткость (6,66+5,11 МПа; /><0,01). В целом проведённый морфометрический анализ позволял предполагать утрату жизнеспособности подобных образований, а их значительная длина свидетельствовала в пользу их происхождении от описанных выше аномально удлинённых клеток, имеющих выраженное нарушение процесса септирования.

Не менее выраженной при культивировании в контакте с суббактериостатической концентрацией ампициллина оказывалась и гетерогенность популяции В.еегеш 1Р 5832. При этом клетки, находящиеся в одной микроколонии могли быть представлены как частично сохранившими свою морфологию удлинёнными палочковыми формами, так и существенно изменившими её клетками, форма которых стремилась к шаровидной (рис. 2, в; в таблице обозначены как объекты 1-го типа). При этом у последних зарегистрировано достоверное

Морфологические и механические характеристики клеток E.coli М2 TG1 и B.cereus № 5832 до и после воздействия суббактериостатических концентраций ампициллина

Штамм Исследуемые Морфологические характеристики Механические

группы*** длина ширина высота площадь объём шерохо- характеристики

(мкм) (мкм) (мкм) сечения (мкм2) (мкм3) ватость модуль

(нм) Юнга (МПа)

Е.соИ К 12 Т01 Контроль 2,46+0,34 1,24+0,27 0,20+0,03 0,20+0,07 0,48+0,16 2,26+0,59 2,74+1,79

Объекты 1 типа 3,40+0,72 ** 1,00+0,34 ** 0,20+0,02 0,16+0,06 ** 0,54+0,23 2,06+0,56 2,03+1,54

Объекты 2 типа 18,52+8,66** 1,30+0,19 0,21+0,03 0,21+0,05 3,88+2,18** 2,25+0,40 3,50+2,18

Объекты 3 типа 11,87+8,01** 1,42+0,20** 0,08+0,03** 0,09+0,03** 1,07+0,83** 13,32+4,85** 6,66+5,11**

Б.сегеш 1Р 5832 Контроль 4,40+0,94 1,53+0,39 0,47+0,06 0,57+0,17 2,50+0,86 2,71+0,75 2,21+1,58

Объекты 1 типа 2,59+0,59** 3,04+0,72** 0,88+0,18** 2,14+0,82** 5,55+2,72** 8,72+2,66** 5,45+3,27**

Объекты 2 типа 3,54+0,80** 2,32+0,61** 0,37+0,09** 0,68+0,30 2,40+1,45* 11,37+3,54** 0,23+0,09**

Примечание. * - р<0,05 (критерий Уилкоксона); ** - р<0,01 (критерий Уилкоксона); *** - пояснения в тексте.

уменьшение длины (до 2,59+0,59 мкм; р<0,01) при одновременном увеличении ширины и высоты до 3,04+0,72 мкм и 0,88+0,18 мкм соответственно (^<0,01). Названные причины обусловили и выраженное увеличение величин площади сечения, а также объёма подобных клеток, составляющего 5,55+2,72 мкм3 (^<0,01) и более чем в два раза превышающего таковой у интактных клеток. При этом вновь в качестве возможной причины подобных изменений могло быть названо растяжение изменившей свою ригидность клеточной стенки под действием внутреннего осмотического давления.

С другой стороны, в противоположность эффектам, зарегистрированным при исследовании эффектов ампициллина на клетки Е.соН К12 Т01, воздействие на Б.сегеш 1Р 5832 вело к существенному изменению показателя шероховатости поверхности, объясняемой экспонированием на ней основной мишени для действия антибиотика. Соответственно обусловленное воздействием ампициллина нарушение трёхмерной пространственной структуры пептидогликана результирова-лось в более чем трёхкратном увеличении шероховатости (до 8,72+2,66 нм; р<0,01) клеток В.сегет 1Р 5832, инкубированных в контакте с ампициллином.

На тех же сканах до 45,37+22,6% клеток (в таблице обозначены как объекты 2-го типа) визуализировались как уплощённые до 0,37+0,09 мкм (р<0,01) образования с характеризуемой модулем Юнга упругостью 0,23+0,09 МПа, что позволяло оценивать их как клетки, утратившие значительную часть внутриклеточного содержимого. При этом дополнительными особенностями подобных объектов являлась еще более выраженная (до 11,37+3,54 нм; р<0,01) шероховатость поверхности, сопровождающаяся расположением вокруг них гранулярных структур размером 261,2+139,0 нм, предположительно представляющих собой фрагменты пептидогликана, освобождённые во внешнюю среду при нарушении целостности клеточной стенки (рис. 2, г).

Заключение

Таким образом, использование атомно-сило-вой микроскопии позволило детально охарактеризовать гетерогенность популяции Е.соН К12 Т01 и В.сегет 1Р 5832 после контакта с суббактериоста-тической концентрацией антибиотика ампициллина, оценить спектр изменений морфологических и механических свойств клеток, а также констатировать гибель некоторых из них при подобном воздействии. Наиболее общим изменением, характерным для обоих использованных микроорганизмов, оказывалось увеличение размера клеток после контакта с ампициллином, предположительно обусловленного действием внутреннего осмотического давления на снизившую свою прочность клеточную стенку. Так, у Е.соН К12 Т01 подобный эффект преимущественно проявлялся через элонгацию клеток, в своих крайних проявлениях приводящем к формированию аномально удлинённых объектов с признаками нарушения сеп-тирования. В свою очередь у В.сегет 1Р 5832 действие внутреннего осмотического давления преимущественно вело к увеличению поперечного сечения клетки, изменяя её форму от палочки к сфере. Кроме того, обусловленная действием антибиотика выраженная дезорганизация поверхностных клеточных структур данного микроорганизма сопровождалась освобождением фрагментов пептидогликана в окружающую среду. При этом вероятной причиной особенностей реагирования Е.соН К12 Т01 и В.сегет 1Р5832 на воздействие ампициллина являются различия в строении их клеточных стенок, в том числе обусловленные особенностями синтеза и трёхмерной организации пептидогликана.

Полученные результаты позволяют по-новому оценить последствия воздействия антибиотика ампициллина на клетки модельных грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, связав их с ранее охарактеризованными механизмами его биологической активности и известными молекулярными мишенями. С другой стороны, для дальнейшей

оценки методом ACM известных и вновь синтезируемых соединений, направленных на нарушение синтеза пептидогликана, проведённые исследования позволяют рекомендовать грампо-ложительные микроорганизмы, экспонирующие данный биополимер непосредственно на своей поверхности. В свою очередь грамотрицательные микроорганизмы представляются модельными объектами, адекватными для использования ACM при оценке биологической активности

ЛИТЕРАТУРА

1. Finberg R. V., Moellering R. C, Tally F. P. The Importance ofbacterici-dal drugs: future directions in infectious disease. Clin Infect Dis 2004; 39: 1314-1320.

2. Binnig G, Quate C. F, Gerber Ch. Atomic force microscope. Phys Rev Lett 1986; 6: 59: 930-933.

3. Dufrêne Y. F. Atomic force microscopy, a powerful tool in microbiology. J Bacteriol 2002; 184: 19: 5205-5213.

4. Camesano T. A., Natan M. J., Logan B. E. Observation of changes in bacterial cell morphology using tapping mode atomic force microscopy. Langmuir 2000; 16: 4563-4572.

5. Олюнина Л. H, Мацкова Ю. А., Гончарова Т. А., Гущина Ю. Ю. Оценка терморезистентности Azotobacter chrococcum методом атомно-силовой микроскопии. Приклад биохим микробиол 2009; 45: 1: 45-50.

6. Perry C. C., Weatherly M., Beale T., Randriamahefa A. Atomic force microscopy study of the antimicrobial activity of aqueous garlic versus ampicillin against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. J Sci Food Agric 2009; 89: 958-964.

мембраноповреждающих факторов. Наконец, сама атомно-силовая микроскопия, являющаяся принципиально новым методом визуализации микрообъектов с нанометровым разрешением, может быть охарактеризована как информативный подход, позволяющий при минимальном дополнительном воздействии на анализируемый образец получать уникальную информацию о последствиях воздействия антибактериальных факторов на модельные микроорганизмы.

7. Yang L, Wang K, Tan W. et al. Atomic force microscopy study of different effects of natural and semisynthetic /в-lactam on the cell envelope of Escherichia coli. Anal Chem 2006; 78: 7341-7345.

8. Рачина С. А., Козлов P. С., Шаль E. П. и др. Анализ антибактериальной терапии госпитализированных пациентов с внебольничной пневмонией в различных регионах: уроки многоцентрового фар-макоэпидемиологического исследования. Клин микробиол антимикроб химиотер 2009; 11: 1: 66-78.

9. Nikiyan A., Vasilchenko A., Deryabin D. Humidity-dependent bacterial cells functional morphometry investigations using atomic force microscope. Intern J Microbiol 2010; Article ID 704170, doi:10.1155/2010/704170.

10. Голутвин И. А., Насикан И. С., Игнатюк Т. E. Новые подходы к исследованию вирусов при помощи сканирующей зондовой микроскопии. Биофизика. 2004; 49: 6: 1105-1111.

11. Salerno M., Bykov /.Tutorial: mapping adhesion forces and calculating elasticity in contact-mode AFM. Microscopy and Analysis 2006; 20: S5-S8.

12. Spratt B. G. Distinct penicillin binding proteins involved in the division, elongation, and shape of Escherichia coli K12. Proc Nat Acad Sci USA 1975; 72: 8: 2999-3003.

Bacillus cereus
Bacillus cereus - это повсеместно встречающиеся грамположительные, спорообразующие, подвижные палочки. Они вызывают у людей желудочные заболевания (диарею и др.), а также септицемию, эндокардит, поражения центральной нервной системы. Заболевание, как правило, непродолжительное и прекращается без какого-либо лечения, однако зарегистрированы также и единичные смертельные случаи. Отчетность о пищевых отравлениях Bacillus cereus не регистрируется, поскольку отмечено относительно низкое число случаев, вызванных ими заболеваний (до 1% от общего числа). Частота заболеваний географически варьирует. Так, в отдельных странах они составляют менее 1% всех пищевых отравлений, в то время как в других - более 30%. Bacillus сereus выделяется из продуктов сравнительно часто, что делает этот вид бактерий значимым индикаторным тест-организмом для пищевой промышленности. Пищевые продукты, подверженные наиболее частому риску заражения - это мясные и молочные продукты, овощи, супы, специи и, в особенности, продукты детского питания. Почти все штаммы Bacillus сereus продуцируют токсины. Цитотоксические энтеротоксины продуцируют почти 95% изолятов Bacillus сereus. Из них негемолитический энтеротоксин (NHE) продуцируют более чем 90% штаммов, а гемолизин BL (HBL) около 55% исследованных штаммов. Полагают, что HBL и NHE образуются в кишечнике больного после употребления продуктов, загрязненных вегетативными клетками или спорами Bacillus сereus. В дополнение к этим двум токсинам некоторые штаммы Bacillus сereus продуцируют термостабильный рвотный энтеротоксин (ЕТЕ). Предполагается, что вначале энтеротоксин ЕТЕ накапливается в пище, причем чаще в продуктах, содержащих крахмал, таких как рис и макаронные изделия. По указанным причинам контроль названных продуктов на содержание энтеротоксинов с применением надежных ускоренных методов тестирования становится все более актуальным.

Патогенность, масштабы заболевания
Bacillus cereus является условно патогенным микроорганизмом, котрый вызывает у человека спорадические пищевые отравления. Bacillus cereus повсеместно распространен в природе. Этиологическая роль Bacillus cereus при пищевых отравлениях первоначально изучена и описана Наugе в 1950 г. Источником пищевых отравлений, обусловленных Bacillus cereus, сперва считали кулинарные изделия, содержащие картофельный крахмал. Затем были описаны вспышки аналогичных отравлений, обусловленные растительными, мясными, рыбными и другими пищевыми продуктами. Наиболее быстро Bacillus cereus размножается в измельченных продуктах (фарш, котлеты, колбаса, кремы). В сырье допускается не более 100 клеток/г, в консервах присутствие Bacillus cereus не допускается. В стерилизованных мясных консервах при соблюдении установленных технологических режимов, клетки этой бактерии отсутствуют. Когда в консервированном продукте остаются жизнеспособные споры, то в условиях хранения консервов при 20 о С может отмечаться размножение возбудителя. На поверхности продукта при этом появляется налет серого цвета, изменяются его запах и консистенция.

Bacillus cereus способен вызывать диарейный синдром также у животных, птиц и насекомых по истечении 6-18 ч после поедания ими зараженного корма. Первично это обусловлено несколькими видами токсинов (NHE, НBL, bc-D-ENT), содержащимися в инфицированной пище, а впоследствии - размножением бактерии в кишечнике. Этот комплекс токсинов Bacillus cereus вызывает цитотоксический эффект и секрецию жидкости в кишечнике. При постановке биопробы на мышах у животных в месте введения наблюдается некроз кожи, а в последующем гибель.

Морфология бактерий и колоний
Палочковидные (0,9-1,5 х 3-5 мкм), спорогенные хемоорганотрофные аэробные или факультативно-анаэробные бактерии из семейства Bacillaceae (под микроскопом клетки-палочки с обрубленными концами внешне напоминают восковые свечи). Эндоспоры расположены центрально, не превышают размер клетки, жгутики - перетрихиально. Бактерии морфологически сходны с Bасillus anthracis, но обладает подвижностью. На селективном агаре образуют колонии диаметром 1,5-2 мм, окруженные зонами преципитата диаметром 4-5 мм. В первые часы роста колонии округлые, выпуклые, затем края колоний становятся изрезанными. Выросшие на агаре колонии имеют восковидный вид. На жидких средах Bacillus cereus образует хлопьевидный осадок, нежную пленку на поверхности и вызывает помутнение бульона.

Физиолого-биохимические особенности
Bacillus сereus - аэроб, но может расти и при недостатке кислорода. На МПА образует крупные, распластанные, серовато-беловатые колонии с изрезанными краями, некоторые штаммы продуцируют розовато-коричневый пигмент, на кровяном агаре вырастают колонии с широкими, резко очерченными зонами гемолиза; на МПБ образует нежную пленку, пристеночное кольцо, равномерное помутнение и хлопьевидный осадок на дне пробирки. Все штаммы Bacillus cereus интенсивно растут при рН = 9-9,5, при рН 4,5-5 рост клеток прекращается. Оптимальная температура роста - 30-32 о С, максимальная - 37-48 о С, минимальная 10 о С. Бациллы чувствительны к действию гамма-фага, гемолизируют эритроциты барана, обладают высокой протеолитической активностью - 80% штаммов разжижают желатин в течение 1-4 суток. Расщепляют до кислоты глюкозу и мальтозу, а часть штаммов также и сахарозу, глицерин, лактозу, галактозу, инсулин, дульцит и декстрин. Бациллы продуцируют энтеротоксины только in vivo, патогенны для белых мышей и морских свинок.

Источники и факторы передачи инфекции
Основной средой обитания Bacillus cereus является почва с нейтральной или слабощелочной реакцией. Из почвы патоген попадает в воздух, воду, пищевые продукты, на одежду и руки людей, кожные покровы животных, на поверхность оборудования пищевых предприятий. Из кишечника здоровых людей и животных Bacillus cereus выявляется редко и в небольших количествах. Размножению Bacillus cereus препятствуют кислая среда и высокая концентрация сахара. При хранении зараженной пищи в холодильнике (при 0…+4°С) патоген не размножается.

Патогенез
Пищевые токсикоинфекции проявляются при употреблении в пищу продукта, содержащего большое количество живых клеток Bacillus cereus, продуцирующих энтеротоксины. Пищевые токсикоинфекции возникают в случаях, когда живые микроорганизмы вследствие различных санитарных и технологических нарушений при приготовлении, хранении и реализации пищевых продуктов, попав в них, начинают интенсивно размножаться и при приеме пищи попадают в организм человека в больших количествах. Инкубационный период у больного колеблется от 3-4 до 10-16 ч. Болезнь возникает внезапно, сопровождается рвотой и острой диареей. Летальность менее 1% и отмечается крайне редко: у лиц с ослабленным здоровьем, главным образом у стариков и детей. Попав в желудочно-кишечный тракт, микробы по лимфатическим путям проникают в кровь, вызывая бактериемию. При этом поступившие в кровь из первичного очага микробы в ней не размножаются, а лишь транспортируются в другие органы и ткани. В клетках ретикуло-эндотелиальной системы бактерии размножаются. Продуцируемый бациллами эндотоксин поражает лимфатический аппарат кишечника, вызывая дистрофические изменения в стенках кишок. Общее недомогание обусловлено действием эндотоксина на центральную нервную систему. Последствием перенесения токсикоинфекции является бактерионосительство, причем в некоторых случаях довольно длительное. Для окружающих больные не опасны; контактное заражение отсутствует, поскольку возбудитель выделяется с рвотными массами и испражнениями непродолжительное время и обладает малой патогенностью. Клиническая картина выражается проявлениями гастроэнтерита (коликообразные боли в животе, тошнота, диарея). Энтеротоксины влияют на транспорт жидкости, электролитов и глюкозы клетками кишечника. Температура тела заболевшего человека обычно в пределах нормы, либо повышается незначительно. Более тяжелые формы заболевания сопровождаются резкой головной болью, рвотой, судорогами и даже потерей сознания. Продолжительность пищевой токсикоинфекции до 4-6 суток. На основании превалирующих симптомов пищевого отравления, вызванного Bacillus cereus, выделяют две формы заболеваний: диарейную и токсикозоподобную (рвотную). Диарейный тип пищевого отравления чаще возникает при употреблении некачественных мяса, рыбы, молока, овощей. При диарейной форме клиническая картина развивается через 24 ч после употребления инфицированного продукта. Температура, как правило, не повышается. Диарейная форма развивается при поступлении в организм больших количеств Bacillus cereus (свыше 10 6 микробных клеток), продуцирующих энтеротоксины диарейного типа. Токсикозоподобная (рвотная) форма пищевого отравления имеет чрезвычайно короткий инкубационный период 0,5-6 ч. Характеризуется тошнотой и рвотой, длящейся до 24 ч. В инфицированном продукте и рвотных массах регистрируется специфический термостабильный рвотный энтеротоксин. Возникновение конкретной формы пищевого отравления зависит от условий размножения Bacillus cereus. Рвотная форма заболевания связана, как правило, с контаминацией крупяных, картофельных и макаронных блюд, салатов, пудингов, соусов. Во всех случаях интенсивному накоплению бактерий и стимулированию токсинообразования способствует нарушение температурных условий и сроков хранения готовых к употреблению блюд и скоропортящихся продуктов. При этом интенсивное размножение Bacillus cereus в таких продуктах происходит при температуре выше 15°С.

Методы обнаружения

Классический метод
Метод основан на выделении Bacillus cereus из колоний, полученных при поверхностном посеве продукта или его разведения на селективные среды. Принадлежность выделенных колоний к Bacillus cereus определяют по морфологическим и биохимическим свойствам [ГОСТ 10444.8-88].

В настоящее время в медицинской практике широко применяются официально зарегистрированные биологические лекарственные препараты, созданные на основе ослабленных штаммов нормальной микрофлоры кишечника.

1. Препараты типа бактисубтил. Препараты, содержащие чистую культуру Bacillus штамма IP 5832 с вегетативными спорами в количестве не менее 1 млрд. Нормализуют физиологическое равновесие кишечной микрофлоры. Содержащиеся в препаратах споры бактерий обладают устойчивостью к действию желудочного сока и в кишечнике прорастают в вегетативные формы. Вегетативные формы бактерий вырабатывают ферменты, расщепляющие углеводы, жиры и белки, в результате чего образуется кислая среда, препятствующая процессам гниения. Препараты способствуют нормальному синтезу витаминов группы В и Р в кишечнике. Выпускаются в капсулах.

2. Препараты типа флонивин БС содержат чистую культуру бациллы штамма 1Р5832 (109) с вегетативными спорами. Штаммы Bacillus IP5832 генетически невосприимчивы ко всем видам сульфаниламидов, нистатину, большинству антибиотиков широкого спектра действия. Выпускается в капсулах.

3. Препараты типа биоспорин содержат Bacillus subtilis, Bacillus lichineformis. Выпускается в капсулах.

4. Препараты типа бифидумбактерин представляют собой лиофилизированную в среде культивирования микробную массу живых бифидобактерий. являющихся важнейшими симбионтами человека, доминирующих в микрофлоре здорового кишечника как детей, так и взрослых. В одной дозе содержится не менее 108 живых бифидобактерий. Выпускаются в таблетках, капсулах, пакетах и во флаконах.

В настоящее время исследуется эффективность жидких бифидобактеринов. Исследованиями российских ученых доказано, что эффективность этих препаратов при дисбактериозах превосходит эффективность сухих бифидобактеринов. При этом лечебный эффект на фоне терапии жидкими бифидобактеринами развивайся через 1-2 месяца, тогда как применение сухих бифидобактеринов приводило к улучшению клинической и лабораторной симптоматики только через 3-6 месяцев. Это связано с тем, что жидкие биопрепараты, во-первых, содержат большее количество микробных тел (1011-1015 в 1 мл объема по сравнению с 108 в сухих препаратах), во-вторых, не содержат посторонней микрофлоры и, в-третьих, жизнеспособность микроорганизмов жидких препаратов оказалось значительно более высокой. То есть живые бифидобактерий полностью сохраняют свои физиологические свойства, вследствие чего они оказывают лечебный эффект за короткие отрезки времени. На основе живых бифидобактерий созданы также препараты типа бифилиз сухой и бифиформ. В состав препаратов типа бифилиз входит лизоцим, благодаря которому он обладает противовоспалительной активностью, кроме того, он стимулирует процессы обмена веществ и эритропоэз. В остальном по фармакологическим свойствам и показаниям к применению эти препараты аналогичны препаратам типа бифидумбактерин.

5. Препараты типа лайфпак пробиотикс - содержат Bifidobacterium bifidum (5x107 микробных тел в 1 капсуле).

6. Препараты типа бификол - сухие комплексные двухкомпонентные биологические препараты из живой бактериальной анаэробной и аэробной микрофлоры кишечника человека штаммов бифидобактерий (Bifidobacterium bifidum I) и кишечной палочки (Escherichia coli M-17). Представляют собой лиофилизированную культуру совместно выращенных бактерий указанных штаммов. 1 доза препарата содержит не менее 107 живых бифидобактерий и не менее 107 особей кишечной палочки М-17. Выпускается во флаконах.

7. Препараты типа колибактерин представляют собой лиофилизат живых бактерий антагонистически активного штамма кишечной палочки М-17, обладают антагонистической активностью по отношению к широкому спектру болезнетворных и условно-болезнетворных микроорганизмов, тем самым нормализуют физиологическое равновесие кишечной микрофлоры. Выпускаются в ампулах и в таблетках.

8. Препараты типа лактобактерин представляют собой лиофилизат живых лактобактерий. Лактобактерий являются составной частью нормальной микрофлоры. Создаваемая лактобактериями кислая среда способствует развитию в кишечнике бифидофлоры и другой нормальной микрофлоры, так как является оптимальной для этих бактерий, и тем самым сохраняет и регулирует физиологическое равновесие кишечной микрофлоры. Выпускаются в ампулах, таблетках и свечах.

9. Препараты типа аципол представляют собой смесь живых ацидофильных лактобактерий и согретых кефирных грибков. Препараты обладают высокой биохимической кислотообразующей и антагонистической активностью. Прогретые кефирные грибки являются иммуномодулятором, стимулирующим защитные свойства организма. Выпускаются во флаконах и таблетках.

10. Препараты типа ацилакт представляют собой лиофилизат живых ацидофильных лактобактерий. Выпускаются во флаконах.

11. Препараты типалинекс - один из наиболее сбалансированных эубиотиков, в состав которого входят живые лиофилизированные бактерии: Lactobacillus acidophilus, Bifidumbakterium infantis v.liberorum, Streptococcus faecium. Эти бактерии являются представителями нормальной микрофлоры кишечника, устойчивы к антибиотикам и химиотерапевтическим средствам. Молочнокислые бактерии, вырабатывая органические кислоты (молочная, уксусная, пропиленовая), создают в кишечнике кислую среду, которая является неблагоприятной для развития болезнетворных и условно-болезнетворных микроорганизмов. В результате этого происходит нормализация физиологического равновесия кишечной микрофлоры. Кроме того, молочнокислые бактерии стабилизируют мембраны эпителиальных клеток кишечника, участвуют в переработке моносахаридов и регулируют электролитное равновесие в кишечнике. Помимо эубиотического действия, комбинация микроорганизмов, входящих в препарат, обеспечивает также бактерицидное и антидиарейное действие. Выпускаются в капсулах.

12. Препараты типа нутролин В содержат спорогенные лактобациллы и витамины В, В2, В6, PP. Выпускаются в виде капсул, таблеток и сиропа.

13. Препараты типа тревис содержат Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus Bulgaricus, Bacillus Bifidum, Streptococcus thermophilus. Выпускаются в капсулах.

14. Препараты типа хилак представляют собой препарат в виде капель для приема внутрь, содержащий стерильный концентрат продуктов обмена веществ субстанций для образования молочной кислоты с продуктами обмена веществ грамположительных и грамотрицательных симбионтов кишечной микрофлоры, а также аминокислоты, короткоцепочные летучие жирные кислоты, биосинтетическую молочную кислоту, молочно-солевой буфер, лактозу. Препараты способствуют поддержанию кислотности в кишечнике в границах физиологической нормы, что приводит к нормализации сапрофитной флоры кишечника и создают неблагоприятные условия для жизнедеятельности болезнетворных микроорганизмов. Под действием препаратов нормализуется естественный синтез витаминов группы В и К. Содержащиеся в препаратах короткоцепочные летучие жирные кислоты обеспечивают восстановление поврежденной микрофлоры кишечника при инфекционных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, повышают регенерирующую способность клеток покровной ткани кишечной стенки, восстанавливают нарушенный водно-электролитный баланс в просвете кишки.

15. Препараты типа энтерол содержат лиофилизированные сахаромицеты буларди (лечебные дрожжи). Оказывают противомикробное действие, являются антагонистами болезнетворных и условно-болезнетворных микроорганизмов: клостридий, стафилококков, кандид, а также лямблий. Повышают местную иммунную защиту в результате повышения иммуноглобулинов. Оказывают антитоксическое действие, улучшают трофику слизистой оболочки кишечника. Выпускаются в виде порошка в пакетиках и капсулах.

На правах рукописи

Гатауллин Айрат Гафуанович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ BACILLUS SUBTILIS, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ПРОБИОТИКОВ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. ИИ. Мечникова РАМН, г. Москва.

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Михайлова НА. доктор биологических наук Блинкова Л.П.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Батуро А.П. доктор медицинских наук, профессор Лиходед В.Г.

Ведущая организация: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Национальный орган контроля Федеральное государственное учреждение науки ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича

Защита состоится ¿3" и&иЯ 2005 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова РАМН.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В медицинской микробиологии накопились данные, обосновывающие использование для коррекции дисбиотических нарушений сапрофитной микрофлоры, микроорганизмы которой в процессе своей жизнедеятельности вырабатывают биологически активные вещества (БАВ), подавляющие рост патогенных микроорганизмов [Михайлова Н.А. и др., 1993; Мазанкова Л.Н. и др, 1997; Осйпова И.Г. и др., 2003].

Лечебные и профилактические препараты на основе живых непатогенных микробов, способные оказывать при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические и биохимические функции организма хозяина через оптимизацию его микробиологического статуса, относят к препаратам - пробиотикам [Шендеров Б.А., 1997].

Для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразуюших бактерий [Слабоспицкая А.Т. и др., 1990; Никитенко В.И., 1991; Никитенко Л.И., Ни-китенко В.И., 1992; Смирнов В.В. и др., 1995; Шендеров Б.А. и др., 1997; Поберий ИА. и др., 1998].

Род Bacillus привлекает внимание исследователей с давних времен. Сведения, полученные в области микробиологии, биохимии, физиологии и генетики бактерий, свидетельствуют о преимуществах Bacillus как продуцентов биологически активных веществ: ферментов, антибиотиков, инсектицидов [Смирнов В.В и др., 1982; Паршина С.Н. и др, 1990; Харвуд К., 1992; Блинкова Л.П. и др, 1994].

Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам послужили обоснованием использования бацилл в различных областях медицины. Управление по контролю за качеством продовольственных и лекарственных средств США, присвоило В. subtilis статус GRAS (generally regarded as safe) го безопасности, являющейся обязательным условием для их применения при производстве лекарственных препаратов [Харвуд К., 1992; Никитенко Л.И., 1992; Кандыбин Н.В. и др., 1995; Ивановский АА., 1996, 1997; Бойко Н.В и др, 1997; Payne J. М, 1992; Kubo К, 1994; Tsuge К. et al., 1995; Rychen G. et al., 1995, Donovan W.P. et al., 1995].

Активность многих представителей рода Bacillus ярко выражена и проявляется в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов Благодаря синтезу разнообразных ферментов и других веществ они регулируют и стимулируют пищеварение, оказывают противоаллергенное и антитоксическое действие Применение бацилл существенно повышает неспецифическую резистентность макроорганизма Кроме того, эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабильны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны [Сороку ю-ва И Б, 1996]

Наибольший интерес для биотехнологии представляет вид В sub lilts Для него создан банк данных по молекулярной генетике SubtiList, в который вносят всю информацию о бактериальном геноме

Бактерии В subtilis широко используются в технологии получения ряда бактериальных и ферментных препаратов [Шаблинскас АИ, 1990, Гулько МА, 1994, Gastro GR, 1992, Dercova К et al, 1992, Kudrya VA, 1994, Lin S-C et al, 1994, Cromwick AM et al, 1996, Buchell M E et al, 1997, Oh M К et al, 1995]

На их основе созданы препараты - пробиотики, характеризующиеся широким диапазоном лечебно-профилактического действия и экологической безопасностью [Нахабин И М, Перелыгин В В, 1996] Споровые пробиотики эффективно используют для лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека и сельскохозяйственных животных [МПТопчий, 1997, VGuida, 1978, Харченко, 1980, Никитенко В И, 1992]

Наиболее известными в настоящее время являются следующие препараты бак-тису бтил, споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген, энтерогер-мин и другие [Смирнов В В и др 1988, 1992, 1995,1997, Никитенко В И, 1989, 1991, 1992, Грачева Н М и др, 1996, Винник Ю Си др,1998, Сорокулова И Б, 1996, 1997, St gard H , 1989, Maruta К, 1996, Su Li et al, 1996, Adami A et al, 1997]

Терапевтическая эффективность споровых пробиотиков обеспечивается биологическими свойствами штаммов, используемых для их производства Определяющее значение при этом имеет спектр их антагонистической активности в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов, являющихся одной из причин нару-

шений микроэкологии в различных биотопах организма человека или животных Кроме того, нельзя не учитывать способности бацилл к продукции различных БАВ, таких, как полипептидные антибиотики, ферменты, бактериоцины и др., а также их антибиотикорезистентность.

Цель работы:

Изучить биологические свойства выделенных штаммов B.subtilis и оценить возможность их использования для разработки оригинального спорового пробиотика

Задачи исследования:

Научная новизна.

На основе изучения морфологических, физиолого-биохимических, генетических и других биологических свойств выделенных штаммов отобран бесплазмидный штамм B.subtilis 1719, проявляющий антагонизм против условно патогенных и патогенных микроорганизмов различных таксономических групп, обладающий низкой адгезивной активностью, устойчивый к гентамицину, полимиксину и эритромицину.

Экспериментально обоснованы подходы к созданию производственной технологии, включающие изучение ростовых свойств штамма B.subilhs 1719 на оригинальных питательных средах, условий стабилизации его жизнеспособности и антагонистической активности как этапов получения нового препарата-пробиотика

Подана заявка на изобретение (№2005111301 от 19 04.2005 г.): «Штамм бактерий Bacillus subtlll.4 1719 - продуцент антагонистически активной биомассы в отношении болезнетворных микроорганизмов, а также протеолитических, амилолитиче-ских и липолитических ферментов».

Практическая значимость.

Выделенный и идентифицированный штамм B.SllbtlllS 1719 депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. Л.А. Тарасевича под №277 и может быть рекомендован для разработки промышленной технологии получения оригинального биотерапевтического препарата-пробиотика.

1. Выделенные три штамма бактериальных культур по морфологическим, фи-зиолого-биохимическим и другим свойствам соответствуют виду В. suhlllts. Они не содержат плазмид, антагонистически активны в отношении условно патогенных и патогенных бактерий разных таксономических групп, имеют низкий или средний уровень адгезии.

2. Штамм B.subtlhs 1719 обладает пробиотическими свойствами, проявляющимися в элиминации условно патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением количественного и качественного состава нормальной микрофлоры при экспериментальном дисбиозе, а также оказывает иммуномодулирующее действие на макроорганизм.

Апробация работы

Материалы доложены на конференции «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса» (Москва, 2003); на конкурсе молодых ученых ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова (Москва, 2004); на обществе

ВОЭМП (Москва, 2004); на 8-ой Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004); на 5-ом съезде «Научного общества гастроэнтерологов» (Москва 2005).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела микробиологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, май 2005 г.).

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 131 странице. Она состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных результатов (5 глав), заключения и выводов. Список литературы включает: 236 источников (169 отечественных и 67 зарубежных). Работа содержит 10 рисунков и 19 таблиц.

Объекты исследований

Штаммы: Bacillus subtilis, изолированные из различных источников окружающей среды.

Культуры микроорганизмов, выделенные от мышей при экспериментальном дис-биозе.

Тест - культуры, используемые для определения антагонистической активности, из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича

Питательные среды:

Мясопептонный агар (МПА), мясопептонный бульон (МПБ), модифицированная среда Гаузе № 2, питательный агар с добавлением 7% NaCl - для выращивания культур, 5% кровяной агар для определения гемолитических свойств, яичный бульон для тестирования лецитиназной активности, казеиновый и картофельный агары для определения ферментативных свойств, АГВ - для оценки антибиотикоустойчивости.

Биохимические свойства бацилл определяли на средах Омелянского с индикатором бромтимоловым синим и карбогидратами - глюкозой, ксилозой, маннитом, лактозой, сахарозой, мальтозой, салицином и эскулином. Для бесспоровых культур использовали углеводсодержащие среды Гисса и среды с аминокислотами.

Утилизацию цитрата и пропионата тестировали на среде Козера, способность восстанавливать нитраты - на бульоне с нитратами. Определение в среде ацетоина

(реакция Фогеса-Проскауэра) проводили на среде Кларка. Способность продуцировать сероводород изучали на среде Клиглера; каталазную активность выявляли в реакции с Н2О2, способность культур вырабатывать индол - на питательном бульоне с индикаторной бумагой; фермент уреазу - на среде Кристенсена с мочевиной.

Кроме того, для изучения структуры микрофлоры мышей использовали холодный сывороточный бульон и раствор Хенкса, дифференциально-диагностические среды: Эндо, СЫ-агар, Плоскирева, стафилококковый и энтерококковый агары, 88-агар, среду Мас-Сопкеу, цетримидный агар, среду Блаурокка, тиогликолевую среду, среду Вильсона Блера и другие.

Для оценки ростовых свойств использовали следующие среды:

Полусинтетическая среда с добавлением картофельно-глицеринового гидроли-зата [Михайлова Н.А. 1995].

Среда № 5 (г/л): калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 0,3; аммоний сернокислый двузамещенный - 2; натрий лимоннокислый 5,5- водный - 2; медь сернокислая 5-водная - 0,005; цинк сернокислый 7-водный - 0,004; железо (II) сернокислое 7-водное - 0,0005; кальций хлористый - 0,165; марганец (II) сернокислый 5-водный - 0,05; магний сернокислый 7-водный - 0,3; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 5.

Среда № 9 (г/л): железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01; магний сернокислый 7-водный - 0,1; кальций хлористый - 0,08; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 5,0; глюкоза - 10,0, дрожжевой экстракт - 3.

Среда ВК-2 (г/л): марганец хлористый - 0,01; кальций хлористый - 0,05; натрий хлористый - 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 2,0; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 2,0; глюкоза - 10,0, пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 10,0.

Среда СПАС-2 (г/л): калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 2,5; натрий хлористый - 5,0; крахмал - 2,5; гидролизат Модифицированной сои - 10,0; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 10,0.

Среда СПАС-4 (г/л): натрий хлористый - 5,0, гидролизат Модифицированной сои - 10,0; экстракт кормовых дрожжей - 1,0; кислотный гидролизат казеина - 5,0.

Среда СПАС-6 (г/л), калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 2,5; натрий хлористый - 5,0, казаминовые кислоты 5,0; гидролизат немодифицированной сои - 10.0, крахмал - 2,5.

Методы исследований

Выделение и идентификацию штаммов микроорганизмов проводили путем высева на дифференциально-диагностические питательные среды в чашках Петри или в пробирках. Культуры помещали в термостат при 37 °С на 18-24 ч. После учета посевов, готовили мазки, окрашивали их по Граму, микроскопировали и отбирали культуры спорообразуюших бактерий [Смирнов В.В., 1983, Murray P.R., 1999]

Изучение морфологии бактериальных колоний.

Для изучения морфологии колоний в микробной популяции готовили 10-кратные разведения исходной культуры в 0,9 % физиологическом растворе и высевали на среду МПА [Смирнов В.В., 1983, Murray P.R., 1999].

Изучение концентрации биомассы.

Концентрацию микробных клеток в культуральной жидкости определяли, используя отраслевой стандартный образец мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича на 10 ЕД.

Определение чувствительности штаммов к антибиотикам

Чувствительность штаммов к антибиотикам изучали диско-диффузионным методом, используя стандартные диски, пропитанные антибиотиками, на среде АГВ [Биргер М.О., 1982; Решедько Г.К., 2003; МУК 4.2.1980-04, 2004]

Физиолого-биохимические свойства изучали по способности утилизировать различные углеводы: глюкозу, ксилозу, маннит, сахарозу, мальтозу и эскулин, лактозу и салицин; по образованию газа при расщеплении глюкозы; по способности расти на средах в присутствии 7% NaCl, восстанавливать нитраты, продуцировать индол, сероводород, синтезировать ферменты: уреазу, протеазу, амилазу и липазу. Оценивали также подвижность штаммов.

Токсичность, токситенпость и вирулентность выделенных штаммов определяли на белых беспородных мышах массой 14-16 г, в соответствии с рекомендованными методиками [Смирнов В.В., 1983, Murray P.R., 1999].

Адгезивную активность штаммов В. sub tills определяли по методу В Брилиса. оценивая индекс адгезии микроорганизмов (НАМ) Адгезию считали низкой при НАМ 1,00 - 2.49, средней при ИАМ 2,5 - 3,99, высокой при ИАМ > 4,0 [Брилис В И., 1982,1990]

Антагонистическую активность тестировали методом отсроченного антагонизма по отношению к полученным из коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича тест - штаммам, используемым при оценке показателей качества препаратов-пробиотиков, [Бойко Н.В., 1989;БлинковаЛ.П. 1994].

Цитотоксический тест для определения концентрации ФНО - а Концентрацию ФНО - а определяли по цитотоксическому действию сыворотки мышей на клетки-мишени линии L929 .

Фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали в цитохимическом тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) фагоцитами мышей и с помощью люминолзависимой хемилюминесценции [Зинкин В.Ю., 2004]

Уровень цитокинов (IL-1P, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-I2, IFN-y) в сыворотках животных определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), используя тест-системы фирмы «Biosource» (Бельгия)

Экспериментальный дисбиоз моделировали на белых беспородных мышах массой 14-16 г, у которых с помощью антибиотика доксициклина гидрохлорида (ОАО «Белмедпрепараты») проводили деконтаминацию нормальной микрофлоры или селективную деконтаминацию условно патогенной пристеночной микрофлоры толстой кишки с помощью фторхинолонового препарата ципрофлоксацина (цифрана, Reddy"s Lab., Индия).

Исследования просветной и пристеночной микрофлоры выполняли, анализируя асептически взятые у мышей фекальные массы и участки толстой кишки [Зуденков А.Е., 2001; Воробьев А.А., 2001,2003].

Для определения адгезивной активности энтероцитов применяли метод «перчатки» в модификации и подсчитывали средний показатель адгезии (СПА) [Горская Н.М., 1994, Брилис В.И., 1982, 1990]

Плазмидный анализ ДНК осуществляли, используя стандартную процедуру, предназначенную для очистки плазмидной ДНК с использованием щелочного лизиса [Остерман Л Д, 1981; Маниатис Т. и др., 1984].

Оценку ростовых свойств питательных сред при культивировании проводили с помощью Автоматизированного рабочего места микробиолога и химиотерапевта «Микроб-Автомат» на базе планшетного фотометра "Multiskan-Ascent" (Termo-Labsystems, Финляндия), оборудованного термостатом и встряхивателем Статистические методы

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методикам (Ашмарин И П, Воробьев А.А., 1962) Результаты считали достоверными при р<0,05. Достоверность различий между средними значениями (X) экспериментальных данных оценивали по критерию Стьюдента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ На ранних этапах работы выделены 15 культур бактерий. Выявлено, что только 3 штамма не обладали гемолитической и лецитиназной активностью (факторами па-тогенности), поэтому они выбраны для дальнейшего изучения.

Микроскопическое исследование мазков показало, что штаммы грамположи-тельны, характеризуются парацентральным и центральным расположением эндоспор.

При изучении культур на агаризованной модифицированной среде Гаузе №2 обнаружено три варианта колоний, характерных для

Все штаммы обладали морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами типичными для представителей Бактерии были подвижны, росли на среде в присутствии 7% NaCl, характеризовались набором различных ферментов, расщепляющих такие субстраты, как: глюкоза, сахароза, мальтоза, ксилоза, эскулин, желатин, крахмал, казеин, редуцировали нитраты, не образовывали сероводород

Известно, что культуры В subtilis обладают выраженными антагонистическими свойствами в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В нашей работе это свойство оценивали с помощью метода отсроченного антагонизма, используя штаммы тест - культур из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича (табл 1).

Таблица 1. Антагонистическая активность штаммов Bacillus subtilis

Зоны задержки роста тест-штаммов (мм) _iX±m)___

Исследуемые штаммы B.subtilis о г- yi г-fi f) С й ^ aureus FDA 209Р S aureus 29213 f, сч Tf ГЧ £ a о a 0 в s s 1 S I X. aureus «Филлииов» а гч 1 Г» с <3 о чО "о ГЧ Г4 О С (N 00 оо гц Гч| M1 "nJ

г- О <Л _ VI m IT) (N о п ГЧ гч +1 fl

№ 1719 N + г- Г4 f, +1 f! +i

in О VI О f о оо _ о о О

№ 1594 <Ч| CJ +1 +1 «-I С сч; п!

О О О О о 00 ft 00 о

№ 1318 Ni г", +1" +1 о! с> !Nj еч fl +1 О fj +1 fi + m + i + о + Г> f + о ГЧ + О CN ГЧ* +1 О + гч гч f. +1 (N

Полученные данные свидетельствовали, что уровень антагонистической активности штаммов отличался в зависимости от используемого тест - штамма. Все три штамма обладали выраженной антагонистической активностью в отношении двух видов шигелл (Sflexncri 337 и s.sonnei 170), S.aureus FDA 209P, S. aureus «Никифоров», P.mirabilis 24a, P.vulgans 177, C.albicans 690, E.coli 1882, P.aeruginosa 9022 и E.coh 212 (O157:H7), причем наибольшие показатели выявлены у штамма B.subtilis 1719, который проявлял антагонизм также против S.aureus 29213, S.aureus 25423.

Необходимо особо отметить, что изучаемые штаммы проявляли достаточно выраженный антагонизм в отношении энтеропатогенного штамма E.coli 212 (0157:Н7), способного синтезировать шигаподобный токсин (цитоверотоксин), причем максимальной активностью (30+2,0) мм обладал штамм B.subtilis № 1719.

Три оригинальных штамма В subtilis изучены на способность к адгезии, которая является одним из наиболее важных свойств пробиотических культур (табл. 2).

Таблица 2. Адгезивная активность штаммов Bacillus subtilis.

Исследуемые штаммы Адгезивная активность

Индекс адгезии микроорганизма (ИАМ) (Х±ш) Уровень адгезии

В. subtilis 1719 1,53+0,08 Низкий

В. subtilis 1594 2,84±0,47 Средний

В. subtilis 1318 3,08±0,33 Средний

Выявлено, что штамм B.subtilis 1719 обладал низкой, а штаммы B.subtilis 1594 и 1318 средней адгезивной активностью.

Антибиотикоустойчивость штамма, кандидата в препараты-пробиотики, является также важным свойством, определяющим возможность его применения совместно с антибактериальными препаратами. В связи с этим, проведено изучение антибиотико-резистентности штаммов B.subtilis к 14 антибиотикам, наиболее часто применяемым в клинике. Штамм B.subtilis 1719 оказался устойчив к гентамицину, полимиксину и эритромицину, а штаммы B.subtilis 1594 и B.subtilis 1318 резистентны только к гентамицину.

Представляло интерес выяснить, связана ли устойчивость к антибиотикам с хромосомной локализацией генетического детерминанта этого признака, или с наличием плазм ид.

Анализ плазмидного носительства штаммами B.subtilis мог предоставить информацию о природе антибиотикоустойчивости. В 0,9 % агарозном геле после проведения электрофореза в ряде анализируемых образцов ДНК (трек 2, 4 и 6) была идентифицирована фракция, совпадающая по размера с плазмидной ДНК (рис.1). Однако характер распределения этих брендов в агарозном геле отличатся от таковых контрольной плазмидной ДНК.

Для того, чтобы окончательно выяснить, являлась ли полученная ДНК плаз-мидной или это были хромосомные фрагменты, выделенный материал обработали мелкощепящими эндонуклеазами второго типа (рестриктазой Pst I). При анализе продуктов рестрикции в агарозном геле (рис. 1) низкомолекулярная фракция ДНК, выде-

ленная из изучаемых штаммов, распадалась без образования четких фрагментов, что свидетельствовало об отсутствии в образцах молекул плазмидной ДНК

Рис. 1. Данные электрофореза препаратов ДНК, выделенных из штаммов

Расшифровка обозначении

По-видимому, выявленная антибиотикоустойчивость, относится к природной устойчивости и, вероятно, контролир) ется генами, локализованными на хромосоме

В опытах in vivo штамм В subtilis 1719 оказался нетоксичным, нетоксигенным, авирулентным

Введение мышам (массой 14-16 г) антибиотика доксициклина гидрохлорида в дозе 5мг позволило создать модель дисбиоза, при которой происходила контаминация кишечника животных условно патогенной и патогенной микрофлорой

Введение культуры В subtilis 1719 в дозе 0,5x10% 1,0х109 м к /мышь в течение 7 дней, способствовало нормализации состава и численности просветной и присте-

№1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9 № 10 №11

маркер процесса

нативная ДНК штамма В ¡ыЫ1Ш 1719 расщепленная ДНК штамма В зыЫШз 1719 нативная ДНК штамма В ¡ыЫ1Ш 1594 расщепленная ДНК штамма В зыЫПк 1594 нативная ДНК штамма В ¡ыЫ1Ш 1318 расщепленная ДНК штамма В 8ыЬШ{8 1318 нативная ДНК штамма В 8ыЫШ 534 расщепленная ДНК штамма В 8ыЬйШ 534 нативная плазмида

расщепленная плазмида рРЕТпБ^ет

ночной микрофлоры, а также элиминации условно патогенных микроорганизмов (табл.3).

Таблица 3. Микрофлора у мышей при экспериментальном дисбиозе и после коррекции культурой Б.тЬиШ (Bs) 1719 в различных дозировках

Г Показатель Ig количества КОЕ/мл у мышей (1г фека ЛИЙ 11

1см кишки) (Х±т)

Контрольные (интакт-ные) После введения После лечения Bs в дозе (микробных клеток)

доксициклнна 0,5x10" 1,0хЮ9

Микроорганизмы я а Пристеночный слой КИШКИ я а о i Пристеночный слой кишки ч я "X Пристеночный слой кишки Я * s s = S с 5 H

е е е & S « ! s g a 3 С

Е. coli: 7+0,42 7+0.7 7.3+0.64 6,5+1.4 710,7 6.5+0.48 811.4 5+0.43

1ас\ % 94 100 64 84 100 100 100 mo

lac, % Ь 0 36 16 * 0 0 0 0

гемолизирующие 0 0 0 0 0 0 0 0 1

Р. vulgaris 0 0 710.26* 0 0 0 * 0 0

P. mirabilis * (1 0 6±0.42* 4.3Й.7* 0* * 0 0 0

С. freundii 610.42* 0 0 0 0 0 0 0

Enterococcus spp. 7±<).21 7+0.64 6±0,59 5.5Ю.84 7±0,42 5.5+0.84 710.48 510.47

S. epidermidis о 0 0 0 0 0 0 0

S. aureus 5±0.21 0 4±1.2* 4+0.21* * 0 0 * 0 » II

Staphylococcus spp. 4+0.43* * 0 0 410,48* 0 0 0 «

Candida spp. 6i0.64 0 4,5±0.21 6+0.92* * 0 * 0 1 0* 0

Lactobacillus spp. ¡9,510,42 7,610.43 1 5.510.4* 1 4+0.23* 910,44 7+0.34 1 910.21 7.5+0,84

1 Bifidobacterium spp. 2±0.1 2±0.1 1 2+0.1 2+0,1 1 2+0.1 2+0.1 2Ю.1 I 210,1

Clostridium spp. 5±0,22 3.1±0.21 1 510.21 4.5+0.24 1 5+0.59 1 4,510,73 1 5М.21 1 4.65+0.24

Примечание: * р<0,05

Подобные результаты получены при селективной деконтаминации условно патогенной пристеночной микрофлоры толстой кишки беспородных мышей с помощью фторхинолонового препарата ципрофлоксацина, сохраняющего численность бифидо-и лактобактерий . Культура В. subnhs 1719,

введенная в аналогичных дозах, приводила к существенном) снижению количества стафилококков (в 8,3 раза) по сравнению с контрольной группой животных, не получавших пробиотическую культуру Введение цифрана животным приводило к резкому изменению соотношения 1ас71ас: бактерий, а введение культуры В ^иЬ1}11\ 1719 изменяло это соотношение до уровня интактных мышей

На следующем этапе изучено влияние культуры В яиЪШа 1719 на адгезивную способность клеток эпитепия кишечника (энтероцитов) при экспериментальном дис-биозе, индуцированном ведением антибиотика доксициклина гидрохлорида

Обозначение групп мышей:

Группы мышей

О Чистые в

начале опыта О Доксициклин

Ш Доксициклин

без аечения В Доксициклин + В вцЫи 0,5 0 Доксицикпин ч-ВвцЫи 1,0 □ Чистые +

В виЬЫк 0,5 ■ Чистые +

В. эиЫИЬ 0,5Х109мк В йиЫШи 1,0 х ] О"м к

Рис. 2. Средний показатель адгезии (СПА) тест-штамма 8.ху1оэк 25 на эн-тероцитах на модели экспериментального дисбиоза и при его коррекции культурой В. suЪtilis 1719.

При коррекции дисбиоза культурой В 8иЪНШ 1719 в различных дозах наблюдалось снижение способности энтероцитов к адгезии (рис 2)

В серии экспериментов по изучению влияния штамма В яиЪШи! 1719 на некоторые иммунологические показатели выявлена способность этих бацилл достоверно

изменять метаболическую активность нейтрофтов по показателям НСТ-теста (рис 3)

Группы животных

Рис. 3. Влияние культуры В SllbtlllS 1719 на активность нейтрофилов (НСТ -тест) при экспериментальном дисбиозе

С помощью метода люминолзависимой хемилюминесценции получены аналогичные результаты по функциональной активности нейтрофилов

Наибольшее повышение его уровня происходило в период максимального проявления дисбиоза, индуцированного введением доксициклина

Под действием К)ЛЬТ)ры В subilla 1719 происходите уменьшение продукции

IФНО-а Введение культуры интактным животным не влияло на уровень продукции

Доксициклин

Группы мышей

Рис. 4. Изучение влияния культуры Б.шЫ1Ш 1719 на уровень продукции фактора некроза опухоли а (ФНО-а) при экспериментальном дисбиозе

Определение накопления цитокинов (1Ь-1Р, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, [Ь-10, 1И2, 1РЫ-у)

в динамике в сыворотках крови мышей после однократного введения культуры В^цЫНю 1719 выявило следующие закономерности.

В первые 12 ч после введения бактериальной культуры изменений в уровне цитокинов не происходило, за исключением 1Ь-1(5. Содержание других изученных цитокинов по сравнению с интактными животными значительно возросло только к 24 ч: И-1Р (в 13,7 раза) и И-4 (в 14, 6 раза). 1Ь-2 (в 5,2 раза), 1Ь-6 (в 7 раза), 1Ы0 (в1,5 раза), 1Ы2 (в 5,2 раза), 1РИ-у (в 9,7 раза).

При производстве препаратов-пробиотиков важным технологическим показателем является выход биомассы при культивировании микроорганизмов. Этот показатель напрямую зависит от ростовых свойств используемых питательных сред. Нами

изучены основные характеристики процессов культивирования Б^иЪйШ 1719 на семи питательных средах различного состава.

Полученные данные представлены в табл.4. Среды №5, СПАС-6 и картофельно-глицериновая среда обеспечивали рост штамма с показателем оптической плотности

(ОП), равным 0,24±0,01 (и=0,03 ч"1), 0,22+0,01 (иККОЗЗч1) и 0,3+0,01 (и=0,025 ч"1) соответственно. На средах СПАС-2, СПАС-4, №9 максимальная величина ОП составляла 0,42+0,03 (и=0,067 ч"1), 0,38+0,02 (и=0,05ч"") и 0,58+0,03 (и=0,037 ч"1) соответственно, а на среде ВК-2 - 0,85±0,6 (и=0,068ч""). Время достижения

максимальной концентрации биомассы на этих средах варьировало в пределах от

9±0,7 ч (СПАС-2) до 18±1,3 ч (КГГ).

Таблица 4. Накопление биомассы штаммов В. ниЬйНн 1719 на средах различного состава в процессе культивирования в течение 20 ч (Х±т)

Среда Среднее время ^-фазы (ч) Длительность экспоненциал ьной фазы (ч) Время достижения тах-концентрации биомассы (ч) Максимальн ый выход биомассы (оптич. плот.) Скорость роста (и)

№5 2 8+0,67 13±1,05 0,24+0,01 0,03

№9 2 11 ±0,8 13+0,99 0,5810,03 0,037

КГГ 2 2±0,12 18+1,3 0,3+0,01 0,025

СПАС-2 2 4+0,36 9±0,7 0,42+0,03 0,067

СПАС-4 2 4±0,34 11+1,1 0,38±0,02 0,05

СПАС-6 1,5 3+0,23 18+1,6 0,22±0,01 0,033

ВК-2 1,5 8±0,72 14±1,0 0,85+0,6 0,068

Максимальный выход биомассы (ОП) выявлен на среде ВК-2, при скорости роста а наименьший на среде СПАС-6 со скоростью роста

Известно, что наиболее часто в качестве источника углеводов в средах для культивирования используются глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза. В наших экспериментах, высокий выход биомассы получен на среде ВК-2 с добавлением глюкозы или сахарозы, показатели ОП соответствовали и

При использовании мальтозы наибольшая ОП зафиксирована на

среде №9 0,695±0,025 (и=0,058 ч "), тем не менее, она оказалась ниже показателей, полученных на среде ВК-2 с включением в качестве источников углеводов лактозы, сахарозы, глюкозы.

Установлено, что состав питательных сред не оказывал какого-либо влияния на антагонистические свойства штамма.

На следующем этапе оценены условия стабилизации жизнеспособности и антагонистических свойств штамма В. ¡ыЫШя 1719 при хранении в лиофилизированном и жидком состоянии при температуре 5±3 °С (табл. 5).

В лиофилизированном состоянии с сахарозо-желтиновым стабилизатором культура ВлыЬШй 1719 сохраняла жизнеспособность и антагонистические свойства не менее 4 лет (срок наблюдения). В табл. 5 представлены также результаты изучения свойств культур, хранившихся в течение 3 лет в жидком виде с добавлением различных стабилизаторов.

Таблица 5. Жизнеспособность клеток штамма В. тЬНШ 1719 при хранении в присутствии различных стабилизаторов

Из данных табл 5 следует, что оптимальным жидким стабилизатором является 7% раствор NaCl, который позволяет сохранять жизнеспособность штамма 1719 в течение 2 лет Для сохранения свойств культуры в течение 1 года возможно также использование дистиллированной воды и 10% раствора глицерина

При хранении в присутствии различных стабилизаторов не происходило статистически значимых изменений антагонистических свойств штамма В subtihs 1719

Сравнительный анализ штамма 1719 по антагонистическим и адгезив-

ным свойствам с коммерческими пробиотических препаратов Споробак-

терин, Россия (В subtihs 534), Цереобиоген, Китай (В cereus DM423), Субтил, Вьетнам (Biemis var vietnamí), Бактисубтил, Франция (В cereus IP5832), Нутролин, Индия (В toagulans) (табл 6), позволил получить следующие результаты

Наибольший уровень антагонистической активности В subi/lis 1719 проявлялся в отношении штаммов S flex neri 337 (30±3,0), S aureus «Никифоров» (30+2,5), P uilgam 177 (30±2,0) P aeruginosa 9022 (27±1,5) и E coli 212 (0157 H7) (30±1,5) Несколько слабее антагонизм выявлен у этого штамма с тест-культурами Ecoh 1882 (26±1,2), Saw eus 25423 (21±1,5), S sonnet 170 (20±2,0), 5 aureus «Филлипов» (20±1,5),

Менее значительная задержка роста выявлена в отношении тест-культур Saurem FDA 209Р (15±1,5), S aureus 29213 (15±3,0), P mirabilis 24a (12±1,2)

Среди изученных пробиотических культур наиболее близким, но уступающим штамму 1719 по антагонистической активности, оказался штамм

534 "Индийский*" штамм В coagulant, оказался слабым антагонистом, уступая по этому признаку всем использованным в опыте штаммам

Сравнение адгезивных свойств показало, что, в основном, штаммы коммерческих препаратов имели средний уровень адгезии, при этом ИАМ колебался от 3,08 до 3,8 кроме ""индийского" штамма (ИАМ=5,36±0,56 У штамма В subtllis 1719 этот показатель оказался самым низким (ИАМ=1,53±0,08)

Таблица 6. Сравнительная характеристика антагонистической активности штамма В. тЬНШ 1719 и культур коммерческих препаратов-пробиотиков в опы-

Зоны задержки роста тест-штаммов (мм) (Х+т)

Исследуемые штаммы Bacillus о Г-- vi Pi с, 3 s н yi с. о сч < с bu S ГЛ (Ч О сч 5 Vi S.aureus 25423 Л", aureus «Никифоров» S 0 5 <=; s 1 ÍÜ 5 1". пи rabil is 24а 0 г-- ¡с 1 о W4 о 3 о сч (Ч о ^ 5 § ^ сч ОС оо "с го ^ г» ■П" о сч Ñ

В. subtihs №1719 Г-(см" +1 N о со +1 о ГЛ щ +i т (Ч +i n 1П (N +1 о f, in +i С СЧ СЧ +¡ so in + Pó о, сч" +1 in сч in +i Г-- (N +Í vo п о Сч" + о с.

В.subtihs 534 Споробактерин (Россия) (-; СЧ +1 CS о +1 о СЧ О ГЛ +1 О го +1 го о. +1 00 +i СЧ (Ч

В. cereus DM423 Цереобиоген (Китай) СЧ +i ч- (N о о <4 О +1 о СЧ +1 <4 in +1 О о (Чг +1 о о о о о с +1

В. cereus var. vietnamí Субтил(Вьетнам) 1П + О о <4 + СЧ О о + (N о" +1 СЧ О, +i О о о + CI + о о О о о

В. cereus IP 5832 Бактисубтил (Франция) Ш оо + in о О г- + о +1 (N in +i in о CN + г"- ■ч- + т о + г" о о о о + г ■п +¡ о

В. coagulans Нутролин (Индия) с о О о + СЧ "Í. О +1 п СЧ o" -H (N О + о о о о о о

Таким образом, выделенный нами штамм В.ъиЫк 1719 по изученным свойствам имел качественные преимущества перед другими испытанными культурами коммерческих препаратов, что позволяет считать его перспективным в использовании для разработки нового пробиотического препарата.

1. На основании морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенные штаммы идентифицированы как В ЯиЫйм. В препаратах ДНК штаммов В.тЫ/Ьх плазмид не обнаружено, что, по-видимому, указывает на хромосомный контроль ан-тибиотикорезистентности.

2. На модели дисбиоза белых мышей показана пробиотическая активность штамма В.зыЫШ 1719, проявляющаяся в элиминации условно-патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением качественного и количественного состава нормальной микрофлоры.

3. Оптимальной средой для накопления биомассы при культивировании штамма

1719 является среда ВК-2 с добавлением в качестве источника углеводов глюкозы или сахарозы.

4. Установлено, что штамм В.яыЫШя 1719 сохраняет жизнеспособность и антагонистическую активность в лиофилизированном состоянии с сахарозо-желатиновым стабилизатором не менее 4 лет (срок наблюдения), в жидкой форме, стабилизированной 7% раствором №01 - 2 года, и 1 год в присутствии дистиллированной воды или 10% раствора глицерина.

5. Антагонистически активный, низкоадгезивный, бесплазмидный, нетоксичный штамм В.яыЫШя 1719, обладающий пробиотической и иммуномодулирующей активностью, депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

6. Штамм В.зыЫШ 1719 (277) по биологическим свойствами и основным технологическим характеристикам перспективен для использования при разработке новых препаратов-пробиотиков.

1 Гатауллин А Г, Гайдеров А А Михайлова Н А, Осипова И Г, Романен-ко Э Е Биологические свойства штаммов ВааНиь sub tills различного происхождения Со «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дета в XXI веке» Пермь 2003, с 329-331

2 Гатауллин А Г, Михайтова Н А, Бтинкова Л П, Елкина С И, Горобец ОБ, Гайдеров А А, Калина НГ Изучение пристеночной микрофлоры кишечника мышей с использованием дифференциально-диагностических сред Сб «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем» Махачкала, 2003 с 48

3 Гатауллин А Г, Бтинкова Л П, Михайтова Н А, Елкина С И, Гайдеров А А, Калина Н Г, Горобец О Б Изменение состава пристеночной микрофлоры при экспериментальном дисбиозе как показатель влияния лечебных препаратов на макроорганизм Анапи Мечниывського шституту Харыв, 2003, №4-5, с 123-124

4 Михайлова Н А, Блинкова Л П, Елкина С И, Гатауллин А Г, Горобец О Б, Гайдеров А А, Калина Н Г Дисбиоз как интегральный показатель побочного действия препаратов Сообщение 1 Сб докладов «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса» М,2003, с 38-39

5 Михайлова Н А, Блинкова Л П, Елкина С И, Гатауллин А Г, Горобец О Б, Гайдеров А А, Калина Н Г Дисбиоз как интегральный показатель побочного действия препаратов Сообщение 2 Материалы II Московского Международного Конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» Москва, 2003, с 162

6 Гатауллин АГ, Блинкова ЛП, Михайлова НА, Елкина СИ, Гайдеров А А, Калина Н Г, Горобец О Б Изменение состава пристеночной микрофлоры как показатель эффективности применения лечебных препаратов при экспериментальном дисбиозе Анали Мечниывського шституту Харыв, 2004, №6, с 10-13

7 Гайдеров А А, Гатауллин А Г, Васильева Е А, Михайлова Н А, Осипова И Г Изучение воздействия препаратов пробиотиков на макрофагальное звено неспецифического иммунитета Сб материалов Международной конференции «Пробиоги-ки, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания Современное состояние и перспективы» М, 2004, с 21-22

8 Блинкова Л П, Михайлова Н А, Елкина С И, Гатауллин А Г, Калина Н Г, Токарская М М Влияние «Милайфа» и его сочетаний со споровым пробиотиком на резистентность белых мышей при экспериментальных инфекциях Сб материалов Между народной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные прод>кты питания Современное состояние и перспективы» М, 2004, с 4041

9 Блинкова Л П, Михайлова Н А, Шмыгалева Т П, Гатауллин А Г, Новиков В Ю, Шмыгал ев П А Адгезивные свойства клеток и спор В subtilis Сб материалов Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания Современное состояние и перспективы» М, 2004, с 41-42

10 Михайлова Н А, Годков М А, Гатауллин А Г, Зинкин Ю В, Ветошкин А И, Харитонова А В, Гайдеров А А Иммуномодмир\ющее влияние культуры В subtilis Сб материалов Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания Современное состояние и перспективы» М, 2004, с 204-205

11 Гатауллин А Г, Михайлова Н А, Блинкова Л П, Романенко Э Е, Елкина С И, Гайдеров А А, Калина Н Г Свойства выделенных штаммов Bacillus subtilis и их влияние на интестинальную микрофлору экспериментальных животных Ж мик-робиол, 2004, №2, с 91-94

12 Гатауллин АГ, Зинкин ЮВ, Ветошкин АИ, Годков МА, Гайдеров А А, Харитонова А В Изучение влияния препарата В subtilis при дисбиозе с помощью хемилюминесцентного анализа Сб материалов Международной конференции «8-ая Международная Путинская школа-конференция молодых ученых» Пущино, 2004,с 256

13 Блинкова Л П, Михайлова Н А, Горобец О Б, Елкина С И, Гатауллин А Г Калина Н Г, Гайдеров А А Экспериментальное изучение воздействия биологически активных препаратов на С albicans Успехи медицинской микологии, 2004, том III, с 48-49

14 Гатауллин А Г, Михайлова Н А, Хватов В Б, Блинкова Л П, Зинкин Ю В, Харитонова А В Применение хемилюминесцентного анализа для оценки анти-

бактериальной и антигрибковой активности препарата В subtil is. Успехи медицинской микологии, 2004, том III. с.50-51.

15. Михайлова НА., Блинкова Л П.. Гатауллин А.Г. Изучение параметров культивирования про биотических штаммов Bacillus subtihs на различных питательных средах. Материалы III Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2005, с.124.

16. Гатауллин А.Г., Блинкова Л.П, Михайлова Н.А. Накопление биомассы пробиотических штаммов В.subtihs в питательных средах различного состава. Сб. материалов Всероссийской научной конференции с международным участием: «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение» Уфа. 2005, ч 1.e. 134-136

Сдано в печать 19 мая 2005г. Объем печати 1 п.л. Заказ № 615. Тираж 100 экз. Отпечатано: ООО «Спринт-Принт» г. Москва, ул. Краснобогатырская, 92 тел.: 963-41-11, 964-31-39

-»« г.и» j » "-"Ж J

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Микробный антагонизм - основа создания биотерапевтических препаратов для коррекции дисбиотических состояний

Глава 2. Споровые пробиотики и их воздействие на макроорганизм

2.1. Препараты из бактерий рода Bacillus

2.2. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus

2.3. Биологически активные вещества, продуцируемые аэробными спорообразующими бактериями

2.4. Факторы патогенности бактерий рода Bacillus 34 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Объекты и методы исследований

3.1. Объекты исследований

3.2. Методы исследований 43 3.2.1. Оборудование и методики

Глава 4. Характеристика выделенных штаммов

4.1. Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов

4.2. Антагонистическая и адгезивная активность штаммов B.subtilis в опытах in vitro

4.3. Определение антибиотикоустойчивости и плазмидного профиля штаммов B.subtilis

Глава 5. Влияние штамма B.subtilis 1719 на макроорганизм

5.1. Изучение токсичности, токсигенности, вирулентности и пробиотической активности штамма B.subtilis 1719 в опытах in vivo

5.2. Изучение влияние штамма В.subtilis 1719 на показатели иммунитета в опытах in vivo при экспериментальном дисбиозе

Глава 6. Технологическая характеристика штамма B.subtilis 1719 как основы пробиотического препарата

6.1. Оценка ростовых свойств на различных жидких питательных средах

6.2. Изучение жизнеспособности и антагонистической активности штамма B.subtilis 1719 при хранении

Глава 7. Сравнительная характеристика свойств штамма B.subtilis\l\9 и штаммов, составляющих основу некоторых коммерческих препаратов-пробиотиков. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиков"

Актуальность проблемы

На современном этапе в медицинской микробиологии появились новые данные, обосновывающие использование сапрофитной микрофлоры, которая способна в процессе своей жизнедеятельности вырабатывать биологически активные вещества (БАВ), подавляющие рост патогенных микроорганизмов, злокачественных опухолей и нормализующие различные патологические и биохимические процессы в организме человека .

В последнее десятилетие для профилактики и лечения заболеваний желу-дочно - кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразующих бактерий .

Бактерии рода Bacillus, одна из наиболее разнообразных и широко распространенных групп микроорганизмов, являются важными компонентами экзогенной флоры человека и животных .

Род Bacillus привлекает внимание исследователей с давних времен. Накопленные знания в области микробиологии, физиологии, биохимии, генетики бактерий свидетельствуют о преимуществах Bacillus как продуцентов биологически активных веществ: ферментов, антибиотиков, инсектицидов . Высокая приспособляемость к различным условиям существования (наличие или отсутствие кислорода, рост и развитие в значительном диапазоне температур, использование в качестве источников питания различных органических или неорганических соединений и т.д.) способствуют распространению бацилл в почве, воде, воздухе, пищевых продуктах и других объектах внешней среды, а также в организме человека и животных.

Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам, послужили обоснованием использования бацилл в различных областях медицины. Управление по контролю за качеством продовольственных и лекарственных средств США, присвоило Bacillus subtilis статус GRAS (generally regarded as safe) - вполне безопасных организмов, что является обязательным условием для применения этих бактерий в производстве лекарственных препаратов .

Активность бацилл проявляется в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря синтезу разнообразных ферментов и других веществ они регулируют и стимулируют пищеварение, оказывают противоаллергенное и антитоксическое действие. При применении бацилл существенно повышается неспецифическая резистентность макроорганизма. Эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабильны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны .

Лечебные и профилактические препараты на основе живых непатогенных микробов, способные оказывать при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические и биохимические функции организма хозяина через оптимизацию его микробиологического статуса, относят в настоящее время к препаратам - пробиотикам .

Из бацилл наибольший интерес вызывают штаммы В. subtilis. По изученности генетических и физиологических свойств они занимают второе место после Е. coli. О больших возможностях В. subtilis в биотехнологии свидетельствует факт создания банка данных по молекулярной генетике этого штамма -SubtiList, в который вносится вся информация о бактериальном геноме .

На основе живых бактерий рода Bacillus, созданы препараты - пробиоти-ки, которые безвредны для макроорганизма, имеют широкий диапазон лечебно-профилактического действия и экологическую безопасность . Важное научно-практическое значение имеют результаты, посвященные использованию живых микробных культур рода Bacillus для лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека и сельскохозяйственных животных .

В настоящее время в практическом здравоохранении широко используют известные препараты - пробиотики: бактисубтил, споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген, энтерогермин и другие .

Показания к лечебному применению и терапевтическая эффективность этих препаратов ограничивается свойствами штаммов, используемых для их производства. Определяющее значение при этом имеет спектр антагонистической активности против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, являющихся причиной нарушения микроэкологии в различных биотопах организма человека или животных. Кроме того, нельзя не учитывать способности бацилл к продукции БАВ (полипептидные антибиотики, ферменты и др.) и их антибиотикорезистентности.

Многообразие и возникающая антибиотикоустойчивость микроорганизмов, участвующих в развитии дисбиотических нарушений, с одной стороны, а также вариабельность биосинтетических возможностей у разных штаммов B.subtilis, с другой, обуславливают целесообразность постоянного мониторинга штаммов, обладающих направленной пробиотической активностью и/или являющихся продуцентами различных БАВ.

Цель работы:

Изучить биологические свойства выделенных штаммов B.subtilis и оценить возможность их использования для разработки оригинального спорового пробиотика.

Задачи исследования:

1. Изучить морфологические, физиолого-биохимические, антагонистические, адгезивные и другие свойства выделенных культур B.subtilis в опытах in vitro и выбрать для дальнейших исследований наиболее перспективный штамм.

2. Оценить пробиотическую активность выбранного штамма B.subtilis в опытах in vivo.

3. Подобрать питательную среду, оптимальную для накопления биомассы изучаемого штамма B.subtilis.

4. Определить жизнеспособность и антагонистическую активность выбранного штамма B.subtilis при хранении.

5. Сравнить свойства оригинального штамма B.subtilis и культур, используемых для изготовления коммерческих препаратов-пробиотиков.

Научная новизна.

На основе изучения морфологических, физиолого-биохимических, генетических и других биологических свойств выделенных штаммов отобран бес-плазмидный штамм B.subtilis 1719, проявляющий антагонизм против условно патогенных и патогенных микроорганизмов различных таксономических групп, обладающий низкой адгезивной активностью, устойчивый к гентамицину, по-лимиксину и эритромицину.

Экспериментально обоснованы подходы к созданию производственной технологии, включающие изучение ростовых свойств штамма В.subtilis 1719 на оригинальных питательных средах, условий стабилизации его жизнеспособности и антагонистической активности как этапов получения нового препарата-пробиотика.

Подана заявка на изобретение (№2005111301 от 19.04.2005 г.): «Штамм бактерий Bacillus subtilis 1719 - продуцент антагонистически активной биомассы в отношении болезнетворных микроорганизмов, а также протеолитических, амилолитических и липолитических ферментов».

Практическая значимость.

Выделенный и идентифицированный штамм B.subtilis 1719 депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича под №277 и может быть рекомендован для разработки промышленной технологии получения оригинального биотерапевтического препарата-пробиотика.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные три штамма бактериальных культур по морфологическим, физиолого-биохимическим и другим свойствам соответствуют виду В. subtilis. Они не содержат плазмид, антагонистически активны в отношении условно патогенных и патогенных бактерий разных таксономических групп, имеют низкий или средний уровень адгезии.

2. Штамм B.subtilis 1719 обладает пробиотическими свойствами, проявляющимися в элиминации условно патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением количественного и качественного состава нормальной микрофлоры при экспериментальном дисбиозе, а также оказывает иммуномодули-рующее действие на макроорганизм.

3. По технологическим характеристикам штамм B.subtilis 1719 можно рекомендовать в качестве кандидата для создания оригинального препарата-пробиотика.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гатауллин, Айрат Гафуанович

1. На основании морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенные штаммы идентифицированы как B.subtilis. В препаратах ДНК штаммов B.subtilis плазмид не обнаружено, что, по-видимому, указывает на хромосомный контроль антибиотикорезистентности.

2. На модели дисбиоза белых мышей показана пробиотическая активность штамма B.subtilis 1719, проявляющаяся в элиминации условно-патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением качественного и количественного состава нормальной микрофлоры.

3. Оптимальной средой для накопления биомассы при культивировании штамма B.subtilis 1719 является среда ВК-2 с добавлением в качестве источника углеводов глюкозы или сахарозы.

4. Установлено, что штамм B.subtilis 1719 сохраняет жизнеспособность и антагонистическую активность в лиофилизированном состоянии с сахаро-зо-желатиновым стабилизатором не менее 4 лет (срок наблюдения), в жидкой форме, стабилизированной 7% раствором NaCl - 2 года, и 1 год в присутствии дистиллированной воды или 10% раствора глицерина.

5. Антагонистически активный, низкоадгезивный, бесплазмидный, нетоксичный штамм B.subtilis 1719, обладающий пробиотической и иммуно-модулирующей активностью, депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. J1.A. Тарасевича.

6. Штамм B.subtilis 1719 (277) по биологическим свойствами и основным технологическим характеристикам перспективен для использования при разработке новых препаратов-пробиотиков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Открытия и достижения современной биологической и медицинской науки позволили разработать и внедрить в практику новые биопрепараты - пробиотики. Основу этих лекарственных средств составляют живые микробные культуры. В основе лечебного действия этих препаратов лежит выраженный микробный антагонизм в отношении патогенных и условно патогенных штаммов - возбудителей болезней. В процессе лечения не менее важной является иммуномодулирующая активность пробиотиков. Неоспоримые преимущества препаратов из живых бактерий перед лекарствами, синтезированными химическим путем, это - безвредность, их физиологич-ность для организма человека, отсутствие аллергических реакций,. Уже сейчас пробиотики заняли лидирующие позиции при коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, нарушениях обмена веществ, лечении последствий антибактериальной, химио-, гормональной и лучевой терапии. В ре зультате исследования феномена транслокации бактерий показано, что пробиотики могут с успехом заменять антибиотики и протеолитические ферменты при профилактике и лечении различных хирургических инфекций.

В последнее десятилетие для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразующих бактерий .

Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам, послужили обоснованием использования бацилл в различных областях медицины. Эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабиль> ны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны .

Высокая активность у штаммов против одного набора тест - культур не гарантирует его активности против других. В связи с этим использование спорового пробиотика ограничено конкретными лечебными целями. Вариабельность нозологических форм гнойно-септических заболеваний и многообразие этиологически значимых для развития дисбиотических нарушений микроорганизмов определяют требования к используемому биопрепарату. Это побуждает исследователей к постоянному скринингу штаммов-антагонистов с заданными свойствами.

Изученные нами штаммы обладали морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами, типичными для представителей В. subtilis, и характеризовались набором ферментов, расщепляющих различные субстраты.

По данным литературы B.subtilis обладают выраженными антагонистическими свойствами в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов и высокой ферментативной активностью, за счет чего нормализуют процессы пищеварения, а также обеспечивают антитоксический и противоаллергический эффект .

Исследованные штаммы B.subtilis имели широкий спектр антагонистической активности, низкий (В. subtilis № 1719) или средний (В. subtilis № 1594, В. subtilis № 1318) уровень адгезии.

Таким образом, изученные нами штаммы характеризовались высокой пробиотической активностью. Однако изучение биохимических свойств показало, что штамм B.subtilis 1719 обладал более высокой ферментативной активностью (протеазной, амилазной, липазной), что выражалось в наибольшей зоне гидролиза исследуемых субстратов. Кроме того, низкий уровень адгезивной активности штамма В.subtilis 1719 и, по-видимому, его природная антибиотикоустойчивость, контролируемая хромосомой, позволили сделать заключение о перспективности дальнейшего изучения этой культуры.

На наш взгляд, перспективы для расширения промышленного выпуска препаратов на основе рода Bacillus очень велики.

Бациллы способны секретировать в культуральную жидкость множество ферментов. Они служат важным промышленным объектом для получения протеолитических и амилолитических ферментов, используемых для производства пищевых продуктов, детергентов и медико-биологических субстанций . В последнее десятилетие с их участием получен ряд новых антибиотиков, бактериальных инсектицидов и других биологически активных веществ .

Несмотря на то, что В. subtilis имеют статус GRAS, в литературе имеются единичные сообщения о наличии факторов патогенности, у некоторых штаммов В. subtilis. Указывается, что это не является постоянным признаком, поскольку исчезает при пересевах. Высказано предположение о взаимосвязи патогенных свойств бактерий с наличием у них плазмид. Например, Le Н. и Anagnostopoulos С. выделили плазмиды из 8 штаммов В. subtilis у 83 обследованных. Плазмидные ДНК были определены только в клетках токсигенных штаммов В. subtilis и не обнаружены в клетках других штаммов одного вида, не обладающих токсигенностью. Элиминация плазмид из токсигенных штаммов под воздействием элиминирующих агентов приводила к устранению токсигенных свойств фильтратов культур. Однако генетическая роль плазмид изучена недостаточно.

В проведенных нами исследованиях, в препаратах выделенной ДНК трех изученных штаммов В. subtilis плазмид не обнаружено.

Авторы, изучавшие воздействие бацилл на организм теплокровных, пришли к заключению, что штаммы В. subtilis совершенно безвредны для человека и животных. Доказательством безвредности для макроорганизма служат экспериментальные данные о том, что уже через несколько дней после парентерального введения, B.subtilis элиминируется из организма . Механизмы лечебного действия этих культур изучали на животных. В настоящее время считают, что терапевтический эффект споровых пробиотиков определяется комплексом факторов, в их числе: продуцирование культурами В. subtilis бактериоцинов, подавляющих рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов; синтез высокоактивных ферментов: протеаз, рибонуклеаз, трансаминаз и др.; продуцирование субстанций, нейтрализующих бактериальные токсины.

Изучение свойств выбранного штамма на мышах показало, что он ави-рулентен, не обладает токсичностью и токсигенностью.

Факторами положительного воздействия пробиотиков на макроорганизм являются различные продукты микробного синтеза: аминокислоты, полипептидные антибиотики, гидролитические ферменты и ряд других биологически активных субстанций, имеющих меньшее значение. Поэтому изучение и выделение протективных субстанций, продуцируемых микроорганизмами рода Bacillus, и создание на их основе медико-биологических препаратов является насущной необходимостью .

В желудочно-кишечном тракте проявляется прямое антагонистическое действие бацилл, которое носит преимущественно избирательный характер в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В то же время они характеризуются отсутствием антагонизма в отношении представителей нормальной микрофлоры.

В проведенных нами исследованиях при коррекции экспериментального дисбиоза, индуцированного введением антибиотика доксициклина, культура В. subtilis 1719 способствовала нормализации состава и численности кишечной микрофлоры, а также элиминации условно патогенных микроорганизмов в пристеночной и просветной микрофлоре.

Из литературных данных следует, что производственные штаммы рода Bacillus обладают низким индексом адгезивной активности к эритроцитам и слабой или средней адгезивностью к эпителиальным клеткам кишечника. Штаммы B.subtilis 534 и ЗН имеют больше адгезинов к рецепторам энтеро-цитов, штамм В. licheniformis - к колоноцитам, т.е. у разных штаммов по-видимому, имеются адгезины к рецепторам разных клеток кишечника .

Их активность осуществляется в просвете кишечника и направлена в отношении патогенных микроорганизмов, не оказывая антагонистического действия на представителей нормальной микрофлоры. При приеме споровых пробиотиков реализуется возможность восстановления аутофлоры в различных локусах кишечника, и через 3-5 суток количество лактобактерий, бифи-добактерий, кишечных палочек и др. увеличивается, а затем восстанавливается до нормальных показателей .

Результаты проведенных нами исследований по изучению адгезии микроорганизмов на энтероцитах, позволяют с большей вероятностью утверждать, что адгезивная способность клеток кишечника зависит от количественного и качественного состава нормальной микрофлоры. При дисбиоти-ческих состояниях происходит открытие рецепторов на поверхности энтероцитов, на которые прикрепляются условно патогенные и патогенные микроорганизмы, а при коррекции дисбиоза происходит колонизация кишечника нормальной микрофлорой и происходит уменьшение количества рецепторов энтероцитов, способных адгезировать на своей поверхности неиндигенные микроорганизмы.

Известно, что нормальная микрофлора играет важную пусковую роль в механизме формирования иммунитета и специфических защитных реакций в постнатальном развитии макроорганизма .

Роль микрофлоры в развитии иммунного ответа обусловлена ее универсальными иммуномодулирующими свойствами, которые включают им-муностимуляцию и иммуносупрессию. Установлено, что бактериальные ли-пополисахариды (ЛПС) оказывают иммунорегулирующее действие на Ig А -иммунный ответ и играют роль адъювантов. Микрофлора обеспечивает развитие комплекса неспецифических и специфических иммунологических реакций, формируя адаптационно-защитные механизмы .

Какой бы высокой антимикробной активностью не обладало лекарственное средство, решающая роль в ликвидации инфекционного патологиче ному статусу. Создание препаратов, эффективных по антимикробным показателям и стимулирующих реакции иммунитета, представляется важной задачей. Поэтому большое количество исследований направлено на изучение влияния препаратов - пробиотиков на разные звенья иммунной системы человека и животных.

Введение живых культур аэробных бацилл заметно стимулирует in vivo продукцию сывороточного интерферона и интерферона, индуцированного in vitro вирусом болезни Ньюкастла .

В ряде работ указывается на то, что препараты - пробиотики оказывают иммуномодулирующее действие, восстанавливая нарушенный патологией иммунный статус, увеличивая продукцию эндогенного интерферона, усиливая функциональную активность макрофагальных клеток, повышая фагоцитарную активность лейкоцитов крови - моноцитов и нейтрофилов .

Нашими исследованиями показано, что культура В. subtilis 1719 достоверно изменяла метаболическую активность нейтрофилов при коррекции дисбиоза и не вызывала изменений функциональной активности нейтрофилов при нормальном состоянии индигенной микрофлоры. Кроме того, установлено, что дисбиоз сопровождался повышением уровня ФНО-а, что свидетельствовало о выраженной фагоцитарной, цитотоксической, адгезивной активности макрофагов, лимфоцитов, а также клеток эндотелия и эпителия тонкой кишки.

Повышенная секреция провоспалительного цитокина у мышей с дис-биозом, вероятно, отражает активацию иммунокомпетентных клеток (Т-лимфоцитов, моноцитов/макрофагов). Под влиянием культуры B.subtilis 1719 * наблюдали снижение продукции ФНО-а. Введение культуры интактным животным, изменений уровня продукции ФНО-а не вызывало.

Учитывая, что ФНО-а является маркером воспалительных реакций, сделан вывод о важной роли пробиотика в повышении противовоспалительной активности иммунокомпетентных клеток у животных.

Проведенные исследования по изучению динамики продукции цитоки-нов под влиянием штамма B.subtilis 1719 показали, что культура не оказывала влияния на продукцию цитокинов в первые часы после введения, кроме IL-lp, количество которого накапливалось постепенно. Уровень других изученных цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y) значительно возрос в интервале от 12 до 24 ч.

Таким образом, модуляция клеток иммунной системы и изменение потенциала цитокинов может быть одним из механизмов, посредством которого культура В. subtilis 1719 способствует коррекции дисбиоза.

Анализ результатов научных исследований, проводимых у нас в стране и за рубежом, свидетельствует о масштабах использования бактерий рода Bacillus для получения продуктов из биомассы бактерий или их метаболитов. Известные способы культивирования бактерий рода Bacillus являются основой для технологии получения ряда бактериальных и ферментных препаратов. .

При изучении ростовых свойств культуры В. subtilis 1719 на различных жидких питательных средах, установлено, что для максимального накопления биомассы наиболее адекватным субстратом для культивирования штамма можно считать среду ВК-2 с добавлением глюкозы или сахарозы

В настоящее время при отборе и характеристике производственных культур микроорганизмов учитываются, главным образом, следующие показателя биологической характеристики: спектр и уровень антагонистической активности, технологичность, т.е. способность к быстрому накоплению био* массы, устойчивость к лиофильному высушиванию, жизнеспособность при хранении. Особое внимание уделяется критериям степени безопасности используемых микроорганизмов для здоровья человека .

В проведенных исследованиях по оценке жизнеспособности микробных клеток B.subtilis 1719 при хранении в присутствии жидких стабилизаторов выявлено, что оптимальным стабилизатором является 7% раствор NaCl, который позволял сохранять жизнеспособность и антагонистические свойства штамма в течение 2 лет. Для сохранения свойств культуры в течение 1,5 лет возможно использование 10% раствора глицерина, 1 года - дистиллированной воды, при этом установлено, что указанные наполнители, статистически значимых влияний на антагонистические свойства штамма B.subtilis 1719 не оказывали. Необходимо отметить, что важным фактом является способность штамма B.subtilis 1719 сохранять антагонистическую активность в отношении S.sonnei и S.aureus в жидких стабилизаторах длительный срок -36 мес. (срок наблюдения).

Лиофильное высушивание с сахарозо-желатиновым стабилизатором сохраняло жизнеспособность и антагонистическую активность штамма B.subtilis 1719 в течение 4 лет (срок наблюдения).

В настоящее время в практическом здравоохранении широко используют известные препараты - пробиотики: бактисубтил, споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген, энтерогермин и другие

Сравнительное изучение штамма B.subtilis 1719 по антагонистической и адгезивной активности с коммерческими культурами следующих пробиоти-ческих препаратов: Споробактерин, Россия (В. subtilis 534), Цереобиоген, Китай {В.cereus DM423), Субтил, Вьетнам {В.cereus var. vietnami), Бактисубтил, Франция (B.cereus IP5832), Нутролин, Индия (B.coagulans), показало, что выделенный штамм является оригинальным и может быть рекомендован в качестве производственного, при получении нового препарата-пробиотика.

Таким образом, по физиолого-биохимическим свойствам штамм B.subtilis 1719 имеет четко различимые индивидуальные признаки, занесенные в паспорт культуры при депонировании в коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Кроме того, доминирующее положение выделенного штамма B.subtilis 1719 по антагонистической активности свидетельствует о перспективности использования этой культуры для разработки на его основе пробиотического препарата.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гатауллин, Айрат Гафуанович, Москва

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Медизд, 1962, 180 с

2. Байбаков В.И., Карих Т.Л., Борукаева Л.А. и др. Нормализация кишечной микрофлоры и общего состояния мышей линии JCR под влиянием концентрата бифидобактерий.//Антибиотики и химиотерапия. 1997. - Т. 42, №3. - С. 20-24.

3. Байда Г.Е., Бударина Ж.И. Первичная структура и анализ гена гемолизина II Bacillus cereus // 2 Откр. гор. науч. конф. мол. Ученых г. Пущино, 23-25 апр. 1997: Тез. докл. Пущино. - 1997 - С. 45-46.

4. Байда Г.Е., Кузьмин Н.П. Ген HLY-III Bacillus cereus, клонированный в Escherichia coli, кодирует новый поро-формирующий гемолизин // Междун. конф. посвящ. памяти акад. А.А.Баева: Тезисы докл., Москва, 20-22 мая 1996. М. - 1996. - С. 108, 291.

5. Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечни-ка//СПб. «Питер». -2000. -209 с.

6. Баханова Е.М., Николаев С.М., Николаева И.Г., и др. Раст. ресурсы. 2001 . Т. 37, вып. 1. С. 70-76. Влияние экстракта из побегов Pentaphylloides fruticosa на течение экспериментальных дисбактериозов кишечника, вызванных сульфадиметоксином и изониазидом

7. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Ильичев А.А. Перспективы конструирования иммунопрепаратов на основе рекомбинантных бацилл // Новые направления биотехнологий: Тез. док. YI Конф. РФ, 24-26 мая, 1994. Пущино. -1994.-С. 68.

8. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Масычева В.А. Рекомбинантные пробио-тики: проблемы и перспективы использования для медицины и ветеринарии // Дисбактериозы и эубиотики: Тезисы докладов Всеросссийской научно-практической конф. М. - 1996. - С. 7.

9. Белявская В.А., Чердынцева Н.В., Бондаренко В.М., и др. Биологические эффекты интерферона, продуцируемого рекомбинантными бактериями препарата пробиотика Субалина. Журн. микробиол., 2003, №2, с. 102-109.

10. Беляев Е.И. Пути усовершенствования препаратов, нормализующих микрофлору кишечника / Респ. сборник научных трудов: «Аутофлора человека в норме и патологии. Горький. - 1988. - С. 74-78.

11. Билибин А. Ф. //Тер. арх. -1967. № 11. - С. 21-28.

12. Билибин А. Ф. // Клин. Медицина. 1970. - № 2. - С. 7-12.

13. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам обследования. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. М.: Медицина, 1982. - С. 180.

14. Блинкова Л.П., Семенов С.А., Бутова Л.Г. и др. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus // ЖМЭИ. 1994. -N5.-С. 71-72.

15. Бойко Н.В., Туряница А.И., Попович Е.П., Вьюницкая В.А. Антагонистическое действие культур Bacillus subtilis на бактерии рода Klebsiella / Микробиол. ж. 1989. - Т. 51, N 1. - С. 87-91.

16. Бойко Н.В., Лисецька М.В. Розробка пробютиюв виб1рковощн: Протискле-ромна ефектившсть деяких штам1в В. subtilis // Наук. вюн. Ужгор. ун-ту. Сер. Бюл. 1997. - N 4. - С. 194-198.

17. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры // Вестник РАМН. -М.- 1997.-N3.-C. 7-10.

18. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И., Мацулевич Т.В. Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. и клин, гастроэн-терол. 2004. № 3. С. 83-87.

19. Бочкарева Н.Г., Белогорцев Ю.А., Удалова Э.В. и др. Штамм бактерий Bacillus subtilis продуцент комплекса гидролитических ферментов, обогащенных b-глюканазой // Пат. N 2046141 Россия, С12 N 9/42, Опубл. 20.10.95. - Бюл. N 29.

20. Брилис В.И. Адгезивные свойства лактобацилл //Автореф. дис. канд. мед. наук. Тарту. -1990. - 25 с.

21. Брилис В.И., Брилине Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Адгезивные и ге-магглютинирующие свойства лактобацилл. Журн. микробиол., 1982, 9: 7578.

22. Васильева В.Л., Тацкая В.Н., Резник С.Р. Опыт применения растительного и микробного адъювантов при получении иммунных асцитных жидкостей у лабораторных животных // Мжробюл. журн. 1974. Т. 36, N 3. - С. 358-360.

23. Вершигора A.E. Основы иммунологии // Киев: Вища школа. 1975. - 319 с.

24. Винник Ю.С., Перьянова О.П., Якимов С.В. и др., Метод лечения гнойных ран с использованием антагонистов / International journal on immunorehabilitation. 1998. - N 4., С. 143.

25. Виноградов Е.Я., Шичкина В.П. Штамм бактерии В. mucilaginosus в качестве продуцента биостимулятора неспецифического иммунитета у телят // А.с. 1210452, СССР -1/00. Опубл. 27.04.96. - Бюл. N 12.

26. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П.Итоги науки и техники: Биофизика 1989; 24: 172.

27. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбакте-риозы актуальная проблема медицины //Вестник АМН. -1997. - № 3. -С.3-9.

28. ВоробьевА.А., Несвижский Ю.В., Зуденкова А.Е., Буданова Е.В. Сравнительное изучение пристеночной и просветной микрофлоры толстой кишки в экспериментах на мышах. Журн. микробиол., 2001, 1: 62-67.

29. ВоробьевА.А., Несвижский Ю.В., Липницкий Е.М. и др. Исследование пристеночной микрофлоры кишечника человека. Журн. микробиол., 2003, 1: 6063.

30. Вьюницкая В.А., Бойко Н.В., Спивак Н.Я., Ганова Л.А./ Некоторые механизмы действия новых микробиотиков // Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства: Сборник тезисов Алма-Ата, 1990. - С. 17.

31. Галаев Ю.В. Патогенные ферменты бактерий // М.: Медицина. 1968. - 115 с.

32. Гончарова Г.И., Семенова А.П., Лянная A.M., и др. Количественный уровень бифидофлоры в кишечнике и его коррелятивная связь с состоянием здоровья человека.// Антибиотики и микроэкология человека и животных. -1988.-С.118-123

33. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции.//Диссертация в форме научного

34. Грачева Н.М., Гончарова Г.И. и др. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение при дисбактериозе кишечника. Методические рекомендации. 1986, С. 23

35. Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Аваков А.А. и др. - Новые лекарственные препараты. 1994, №1, С. 3-12

36. Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Соловьева А.И. и др. Эффективность нового бактерийного препарата биоспорина при лечении острых кишечных инфекций // Журн. микробиол. 1996. - N 1. - С. 75-77.

37. Гребнева A.J1., Мягкова Л.П. Кишечный дисбактериоз//Руководство по гастроэнтерологии в 3 т. М., 1996. -Т.З. -С.324-334

38. Григорьева Т.М., Кузнецова Н.И., Шагов Е.М. Штамм Bacillus thuringiensis 4КН, синтезирующий экзотоксин со специфической активностью против колорадского жука// Биотехнология. 1994. - N 9-10. - С. 7-10.

39. Гулько М.А., Казаринова JI.A., Позднякова Т.М. Способ получения инозина // Пат. N 175583, С12Р 19/32. Опубл. 30.08.94. - Бюл. N 16.

40. Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С., Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике. Журнал Цитоки-ны и воспаление, 2003, Т. 2, № 3, с. 20-35

41. Егоров Н.С., Зарубина А.П., Выборных С.Н., Ландау Н.С. Синтетическая * среда для выращивания бактерий рода Bacillus // Вестник МГУ. 1989. N 4.1. С. 52.

42. Ермакова Л.М., Смирнова Т.А., Алиханян С.И. и др., Кристаллические включения у мутанта Bacillus subtilis с измененным спектром протеиназ // Докл. АН СССР. 1977. - Т. 236, N 4. - С. 1001-1003.

43. Жирков И.Н., Братухин И.И. Применение пробиотика РАС для коррекции дисбактериозов у телят// Ветеринария. 1999. N 4. - С. 40-42.

44. Згонник В.В., Фуртат И.М., Василевская И.А. и др. Антагонистические свойства спорообразующих бактерий, контаминирующих процесс производства лизина//Микробиол. ж. 1993. -Т.55, N4. - С. 53-58.

45. Зинкин В.Ю. Фотометрический НСТ-тест с нейтрофилами крови человека и его клинико-иммунологическая значимость у больных с травмой опорно-двигательного аппарата. Автореф. дис. канд. мед. наук.- Москва, 2004.

46. Зуденков А.Е. Микрофлора и состав иммунокомпетентных клеток пристеночного муцина толстой кишки в норме и при некоторых патологических состояниях. Автореф. дис. канд. мед. наук,- Москва, 2001.

47. Ивановский А.А., Новый пробиотик бактоцеллолактин при различных патологиях у животных // Ветеринария. 1996 - N11. - С. 34-35.

48. Ивановский А.А., Вепрева Н.С., Зимирева В.В., Лагунова О.П. Способ получения пробиотика для ветеринарии / RU Патент N 2084233, опубл. 20.07.97. Бюл. N 20.

49. Кандыбин Н.В., Ермолова В.П., Смирнов О.В. Итоги и перспективы применения бактокулицида // Совр. достиж. биотехнол.: Матер. 1 Конф. Сев.-Кавк. региона, Ставрополь, сент. 1995. Ставрополь. - 1995. - С. 14-15.

50. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры.//Русский медицинский журнал. 2000. - Т. 8, №13-14. - С. 572-575.

51. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Рубакова Э.И. Система цитокинов. М., 2000.

52. Козачко И.А., Вьюницкая В.А., Бережнизкая Т.Г. и др. Бактерии рода 4 Bacillus перспективные культуры для создания биологических средств защиты растений от болезней.// Мшробюл. ж. - 1995.- Т.57, N 5. - С. 69-78.

53. Красноголовец В.Н. Дисбактериоз кишечника. М., 1979. -198 с.

54. Кудрявцев В.А.,Сафронова JI.A., Осадчая А.И. и др. Влияние живых культур Bacillus subtilis на неспецифическую резистентность организма // Мик-робиол. ж. 1996 - Т.58, N 2. - С. 46-53.

55. Кузнецова Н.И., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н. и др. Штамм Bacillus thuringiensis, токсичный для комнатной мухи // Биотехнология. 1995. -N3-4.-С. 11-14.

56. Лапчинская А.В., Шендеров Б.А. Коррекция дисбактериозов, вызванных цефалексином, некоторыми иммуномодуляторами.//Медицинские аспекты микробной экологии. М., 1991. -С.70-79

57. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.Т., Микельсаар М.Э. с соавт. Лактофлора и колонизационная резистентность.//Антибиотики и мед. биотехнология. -1987. -32. -№3. -С. 173-180.

58. Лещенко В.М. Клиника, диагностика и лечение висцерального кандидамикоза. Методические рекомендации. М., 19871.

59. Лисецька М.В. Експериментальне визначення антагонютичжм активносп штам1в Bacillus subtilis щодо Klebsiella rhinoscleromatis // Наук. вюн. Ужгор. ун-ту. Сер. Бюл. 1997. - N 4. - С. 207-212

60. Лопатина Т.К. с соавт. Иммуномодулирующее действие препаратов* эубиотиков //Вестник РАМН. М., «Медицина». -1997. №3. -С.30-34

61. Лукин А.А. Антибиотикообразование и споруляция у плазмидных и бес-плазмидных микроорганизмов // Пущино. 1978. - С. 25-28.

62. Мазанкова JI.H., Михайлова Н.А., Курохтина И.С. и др. Бактиспорин новый пробиотик для лечения острых кишечных инфекций у детей// Человек и лекарство: Тез. докл. V Российского Национального Конгресса, Москва, 8-12 апреля 1997г. - М. - С. 199.

63. Мазанкова Л.Н., Ваулина О.В. Новые лекарственные средства для коррекции дисбиотических нарушений.//Детский доктор. 2000. №3. - С. 51-53.

64. Маниатис Т., Френч Э., Сэмбрук Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование, 1984.

65. Марков И.И., Жданов И.П., Марков А.И. Штамм Bacillus subtilis МЖ-6 антагонист микобактерий туберкулеза // Пат. N 2120992, С 12N 1/20. - Опубл. 27.10.98.-Бюл.N30.

68. Микшис Н.И., Шевченко О.В., Еремин С.А. и др., Популяционная гетерогенность штаммов Bacillus anthracis II Деп. в ВИНИТИ 04.06.98. Саратов. -1998.-7 с.

69. Митрохин С.Д. // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - № 8. - С.46 - 50.

70. Митрохин С.Д. Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс-диагностике и контроле лечения дисбиоза толстой кишки: Автореферат дис. д-ра мед. наук, М., 1998. 37 с.

71. Митрохин С.Д., Ардатская М.Д., Никушкин Е.В., Иваников И.О. и др. - М., 1997. 45 с. Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбакте-риоза (дисбиоза) кишечника в клинике внутренних болезней (Методические рекомендации).

72. Митрохин С.Д., Шендеров Б.А.Микробиологические и биохимические показатели изменения микробной экологии толстой кишки крыс под влиянием рифампицина. Антибиотики и химиотерапия - 1999, Т. 34 № 6 (482-4).

73. Молчанов O.JL, Позняк A.JI. Применение биоспорина в комплексной терапии бактериального вагиноза // Тез. докл: Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней. Санкт-П. - 1999 г. С. 187.

74. Музыченко JI.A., Сенаторова В.Н., Альховская JI.JI. и др. Морфометрический анализ развития микроорганизмов / Биотехнология. 1990. - N 3. - С. 3-6.

75. Мюллер Г., Литц П., Мюнх Г. Микробиология пищевых продуктов растительного происхождения// М.:Б.и..- 1977.- С.343 347

76. Никитенко В.И. Бактериальный препарат для профилактики и лечения вос-«. палительных процессов и аллергических заболеваний // Международная заявка. N 89/09607, WO, публ. 19.10.1989.

77. Никитенко В.И. Вместо лекарств бактерии // Наука в СССР. - 1991. - N 4. -С. 116-121.

78. Никитенко В.И. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения молочного продукта, предназначенного для лечения диатеза, дисбак-териоза и бактериальных инфекций // А.с. N 1648975, S.U. публ 15.05. 91.

79. Никитенко В.И., Никитенко И.К. Штамм бактерий Bacillus pulvifaciens, используемый для изготовления лечебно-профилактического препарата против бактериальных инфекций у животных // А.с. N 1723117, S.U. публ. 12. 1992.

80. Никитенко В.И., Никитенко И.К. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения препарата для профилактики и лечения противовоспалительных процессов и аллергических заболеваний // А.с. N 1723116, S.U. опубл. 12. 1992.

81. Никитенко Л.И., Никитенко В.И. Штамм бактерий Bacillus sp. компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергии // А.с. N 1710575, S.U. - публ. 5. 1992.

82. Никитенко В.И., Горбунова Н.Н., Жигайлов А.В. Споробактерин новый препарат для лечения дисбактериозов и гнойно-воспалительных процессов // Дисбактериозы и эубиотики: Тезисы докладов Всерос. научно-практ. конф. -М.- 1996.-С. 26.

83. Николичева Т.А., Тараканов Б.В., Голинкевич Е.К., Комкова Е.Е. Изменение биоценоза пищеварительного тракта поросят при включении в рацион Bacillus micilaginosis // Бюл. ВНИИ физиол., биохимии и питания с-х животных. 1989.-N 2. - С. 31-35.

84. Обухова О.В., Соболева Н.Н. О наличии фактора распространения в культурах сапрофитных споровых бактерий // Журн. микробиол. 1950. - N 12. С. 482-485.

85. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические рекомендации МУК 4.2.1980-04, 2004.

86. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A. Влияние кислотности среды и температуры на рост и экскрецию полисахаридов Bacillus subtilis при глубинном культивировании // Мисробюл. журн. 1998. - Т. 60., N 4. - С. 25-32.

87. Осипова И.Г. Некоторые аспекты механизма защитного действия колибак-терина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля.// Автореф. дис.канд.биол.наук.- М., 1997.- 25 с.

88. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Терешкина Н.В., Григорьева JI.B. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых про-биотиков // Журн. микробиол. 1998. - N 6. - С. 68-70.

89. Осипова И.Г., Михайлова Н.А., Сорокулова И.Г., Васильева Е.А., Гайде-ров А.А. Споровые пробиотики. Журн. микробиол. - 2003. №3. с. 113-119.

90. Остерман Л.Д. Методы Исследования белков и нуклеиновых кислот. 1981.

91. Панин А.Н., Серых Н.И., Малик Е.В. и др. Повышение эффективности пробиотикотерапии у поросят/ Ветеринария, 1996. - N 3. - С. 17.

92. Панчишина М.В., Олейник С.Ф. Дисбактериоз кишечника. Киев, 1983

93. Паршина С.Н., Имшенецкий А.А., Нестерова Н.Г. и др. Штамм бактерий Bacillus сегеш"-продуцент протеолитических ферментов с тромболитическим действием // А. с. N 1615177, С 12N 1/20. Опубл. 23.12.90. - Бюл. N 4. 1988.

94. Перт С. Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М. Мир, 1978, 332 с

95. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Вахитов Т.Я. Конструирование препаратов для лечения и профилактики дисбактериоза на основе представлений о эндо-экологии человека // Рус. ж. Вич/Спид и родст. пробл. 1997.- Т. 1, N 1. С. 161-162.

96. Петровская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии. М.:Медицина. -1976. -217 С.

97. Поберий И.А., Харечко А.Т., Садовой Н.В., Литусов Н.В. Новый комплексный эубиотик «биоспорин» для детей и взрослых / Здравоохранение Башкортостана. 1998. -N 1. - С. 97-99.

98. Погосян Г.П., Надирова А.Б., Калиев А.Б., Карабаев М.К. Плазмида pCLl и антимикробная активность штамма Bacillus sp. 62 II Молекулярная генетика, микробиол. и вирусология. 1999. - N 1. - С. 37-38.

99. Подберезный В.В., Париков В.А. Среда для культивирования бактерии-симбионта Bacillus pulvifaciens или Bacillus subtilis - продуцента пробиоти-ка// RU Патент № 2100029, опубл. 27.12.97. Бюл.№36.

100. Подберезный В.В., Полянцев Н.И., Ропаева Л.В. Культивирование производственных штаммов Bacillus subtilis в подсырной сыворотке // Ветеринария.- 1996.-N 1.-С. 21-29.

101. Подопригора Г.И. Иммунные и неспецифические механизмы колониза-ционнной резистентности.//Антибиотики и колонизационная резистентность/Груды ВНИИ антибиотиков.- М. -1990. -вып.Х1Х. -С. 15-25.

102. Полховский В.А., Буланов П.А. О декарбоксилазах аминокислот у Bacillus cereus //Микробиология. 1968. - Т. 37, N 4. - С. 600-604.

103. Поспелова В. В., Грачева Н.М., Антонова Л. В. и др. Биологические микробные препараты, их лекарственные формы и сферы применения //Новые лекарственные препараты: Экспресс информация. -1990. -Вып. 5. - С. 1-8.

104. Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Халенева М.П. и др. Новые сферы применения микробных биопрепаратов для коррекции бактериоценоза организма человека.//Иммунобиол. препараты. М. -1989. -С. 142-152.

105. Резник С.Р. Способ лечения и профилактики вирусных и бактериальных заболеваний животных // SU, А.с. N 1311243, опубл. 1982.

106. Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. и др. Профилактический биопрепарат споролакт // Патент N 2035186. RU. - А 61 К 35/66, публ. 20.05.95, бюл. N 14.

107. Резник С.Р., Шуст И.И. Гематологические и цитохимические показатели телят при даче препарата Бактерии- SL // Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа: Тез. докл. Всесоюзн. симпоз. -Киев, 1989. С. 25.

108. Решедько Г.К., Стецюк О.У. Особенности определения чувствительности микроорганизмов диско-диффузным методом. Современные методы клинической микробиологии, выпуск 1. Смоленск, 2003.

109. Ряпис JI.A., Липницкий А.В. Микробиологические и популяционно-генетические аспекты патогенности бактерий // Журн. микробиол. 1998. - N 6. С. 109-112.

110. Савицкая К.И. Нарушения микроэкологии желудочно-кишечного тракта и хронические болезни кишечника // Terra medica. - 1998. N 2. - С. 13-15.

111. Свечникова Е.Б., Максютова Л.Ф., Хунафин С.Н. и др., Опыт использования бактиспорина в комплексном лечении детей с термической травмой // Тез. докл: Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней. Санкт-П. - 1999 г. - С. 268.

112. Синев М.А., Бударина Ж.И., Гавриленко И.В. и др., Доказательство существования гемолизина II Bacillus cereus: клонирование генетической детерминанты гемолизина II // Молек. биол. 1993. - Т. 27, N 6. - С. 1218-1229.

113. Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С., Резник С.Р. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов // Микробиол. ж. 1990. - N2. - С. 9-14.

114. Смирнов В.В.,Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - Киев, 1982 - 280 с.

116. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ// Киев. Нау-кова думка.- 1983.- 278 с.

117. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. О некоторых механизмах возникновения бессимптомной бактеремии // Микробиол. журн. 1988 -Т. 50,N6.-С. 56-59.

118. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Способ лечения гнойно-септических послеродовых заболеваний суспензией живых культур // А. с. N 1398868 S.U. - А 61 К 35/74. - публ. 30.05.88, бюл. N 20.

119. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека // А. с. N 1722502. S.U. - А 61 К. 39/02, публ. 30.03.92.

120. Смирнов В.В.,Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол. журн. 1992. - Т.54, N 6.- С. 82-92.

121. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А., и др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода BacillusII Микробиол. журн.- 1993.- 55,- № 4.С.92-112

122. Смирнов В.В., Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A. Рост и спорообразование Bacillus subtilis в различных условиях аэрации // Микробиол. журн. 1993. - Т. 55, N 3. - С. 38-44.

123. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Профилактический биопрепарат субалин // Патент N 2035185, RU. А 61 К 35/66, публ. 20.05.95, бюл. N 14.

124. Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Осипова И.Г. Биопрепарат субтикол для профилактики и лечения инфекционных болезней // Патент N 2129432. -А. 61 К 35/74. - Бюл. N 12, опубл. 27.04.99.

125. Смирнов В.В., Рева О.Н., Вьюницкая В.А. Создание и практическое применение математической модели антагонистического действия бацилл при конструировании пробиотиков // Мшробюлопчний журн. 1995. -Т. 64, N 5. -С. 661-667.

126. Смирнов В.В., Косюк И.В. Адгезивные свойства бактерий рода Bacillus-компонентов дробиотика // Мшробюлопчний журн. 1997. - Т. 69, N 6. - С. 36-43.

127. Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов // Антибиотики и химиотерапия. -1996. Т.41, N 10. - С. 13-15.

128. Сорокулова И.Б. Сравнительное изучение биологических свойств био-спорина и других коммерческих препаратов на основе бацилл // Мшробю-лопчний журнал. 1997. - Т. 69, N 6. - С. 43-49.

129. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов / Антибиотики и химиотерапия. 1998. - Т. 43, N 2. - С. 20-23.

130. Сторожук П.Г., Быков И.М., Сторожук А.П. Патогенетическая направленность белкового питания и заместительной ферментотерапии при имму-нодефицитных состояниях организма // International journal on immunorehabilitation. 1998. - N 10., С. 110-115.

131. Таболин В.А., Бельмер С.В., Гасилина Т.В. и др. Рациональная терапия дисбактериоза кишечника у детей. Методические рекомендации. М., 1998. -11с.

132. Топчий М.П. Применение препаратов из живых культур сенной палочки при дисбактериозах у телят: Автореф. дис. канд. биол. наук. Минск, 1997. -21 с.

133. Тришина Н.В. Связь между развитием дисбактериоза кишечника и состоянием антиэндотоксинового иммунитета. Автореф. дис. канд. мед. наук. -Москва, 2003., 24 с.

134. Учитель И.Я. Макрофаги в иммунитете. М 1978; 175.).

135. Фазылова А.А. Клинико-иммунологическое обоснование применения споробактерина и бактиспорина при дисбиозе кишечника у детей раннего возраста // Авт. кан. дис. Уфа. - 1998. - 24 с.

136. Харвуд К. Бациллы. Генетика и биотехнология. М., 1992. - С. 52.

137. Харченко С.Н., Резник С.Р., Литвин В.П. Способ борьбы с плесневением кормов // А.с. N 751382, СССР., опубл. в Б.И., 1980, N 28.

138. Хмель И.А., Чернин Л.С., Леванова Н.Б. и др. Штамм бактерий Bacillus pumilus для получения препарата против фитопатогенных микроорганизмов // Патенты 1817875 Россия F01N 63/00, C12N 1/20. опубл. 20.05.95. - Бюл. N 14.

139. Чернякова В.И., Береза Н.М., Селезнева С.И. Бактериологическая и иммунологическая эффективность препарата биоспорина при неспецифическом язвенном колите // Микробиол.ж. 1993. - Т. 55, N 3. - С. 63-67.

140. Чхаидзе И.Г., В.Г. Лиходед, и др. Корректирующее действие антител при экспериментальном дисбактериозе // Журн. Микробиол. 1998, №4: 12-14.

141. Шарп Р., Скавен М., Аткинсон Т. Бациллы: Генетика и биотехнология. -М. 1992. - 398 с.

142. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса//Вопр.питан. -1999. -Т.68. -№2. -С.32

143. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание.-М., 1998, Т. I, С. 287.

144. Шендеров Б.А. Колонизационная резистентность и химиотерапевтиче-ские и антибактериальные препараты.// Антибиотики и колонизационная резистентность: Труды ВНИИ антибиотиков. М. -1990. -вып.Х1Х. -С.5-16.

145. Шендеров Б.А., Манвелова М.А., Степанчук Ю.Б., Скиба Н.Э. Пробиотики и функциональное питание // Антибиотики и химиотерапия. 1997. - Т. 42, N 7. - С.30-34.

146. Шендеров Б.А.Медицинская микробная экология и функциональное питание.-М., 1998, Т. II, С. 413

147. Ямпольская Т.А., Великжанина Г.А., Жданова Н.И. и др. Штамм бактерий Bacillus subtilis продуцент L-фенилаланина: А.с. N 1693056, С 12 Р 13/22, опубл. 23.11.91. Бюл. N 43.

148. Adami A., Sandrucci A., Cavazzoni V. Piglets fed froom birthwith the probi-otic Bacillus coagulans as additive: Zootechnical and microbiological aspects // Ann. microbiol. ed enzimol. 1997. - V. 47, N 1. - P. 139-149.

149. Azuma I., Sugimura C., Iton S. Adjuvant activity of bacterial glycolipids // Jap. J. Microbiol. 1977. - V. 20, N 5. - P. 465-468.

150. Benedettini J. et al. Immunomodulation by Bacillus subtilis spores // Boll. 1st, SieroteMilan. 1983.-V. 62.,N6.-P. 509-516.

151. Berkel H., Hadlok R. Lecithinase-und Toxinbildung durch Stamme der Gat-tung Bacillus // Lebensmittelhygiene. 1976. - V. 27, N 2. - p. 63-65.

152. Bernheimer A., Avigad L. Nature and Properties of Cytolytic Agent produced by Bacillus subtilis // J. Gen. Microb.- 1970. V. 61, N 2. - P. 361-369.

153. Blaznic J, Kumel I.M., Salamum B. et al. Sdravljenje kronicne granulomotozne bolezni z acidofilnem mlecom // Zdrav.Vesth. 1976. N 45. - P. 77-79.

154. Boer A.S., Priest F., Diderichsen B. On the industrial use of Bacillus licheni-formis: A review // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1994. - V. 40, N 5. - P. 595-598.

155. Buchell M.E., Smith J., Lynch H.C. A phisiological model for the control of erytromycin production in batch and cyclyc fed batch cuiture // Microbiology. -1997. V. 143, N 2. - P. 475-480.

156. Cipradi G. et al. Effects of an adjunative treatment with Bacillus subtilis for foodallergy // Chemioterapia. -1986. 5, N6. -P.408-410

157. Cromwick A.M., Birrer G.A., Gross R.A. Effects of pH and aeration on y-poly (glutamic acid) formation by bacillus licheniformis in controlled batch fermentor cultures // Biotechnol. and Bioeng. 1996. - V. 50, N 2. - P. 222-227.

158. Danchin A., Glasser P., Kunst F. et al. Bacillus subtilis devoile ses genes // Biofutur. 1998. - N 174. - P. 14-17.

159. Devin K.M. The Bacillus subtilis genome project: Aims and progress // Trends Biotechnol. 1995. - V. 13, N 6. - P. 210-216.

160. Donovan W.P., Rupar M.J., Slanei A.C. Bacillus thuringiensis crytic, protein toxic to coleopteran isects // Патент N 5378625 США A61K 31/00. Опубл. 03.01.95.

161. Dubos R. Toxic factors in enzymes used in laundry products // Science. 1971. - N 3993. - P. 259-260.

162. Edlund C., Nord C.E. Effect of qinolones on intestinal ecology. Drugs, 1998, 58(2): 65-70.

163. Flindt M. Pulmonare disesase due to ingalation of derivates of Bacillus subtilis containing proteolytic enzyme // Lancet.- 1969. V. 1, N 7607. - P. 1177-1181.

164. Fox M. The phylogeny of procaryotes// Science. -1980. V. 209, N 4455. P. 457-463.

165. Fuller R. J Appl Bacteriol 1989; 66: 5: 365-378.

166. Gastro G.R., Ferrero M.A., Abate C.M. et al. Simultaneous production of alpha and beta amylases by Bacillus subtilis Mir-5 in batch and continuous culture // Biotechnol. Lett. 1992. - V. 14, N 1. - P. 49-54.

167. Glatz B.A., Spira W.M., Goepfert J.M. Alteration of vascular permeability in rabbits by culture filtrates of Bacillus cereus and related species // Infect, and Immunol. 1974. V. 10, N 2. - P. 299-303.

168. Guida V., Guida R. Importansia dos Bacillos esporulados aerobios em gastroenterologia e nutricao // Rev. Brasil. med. 1978. - V. 35, N 12. - P. 702707.

169. Haenel H., Bending J. Intestinal flora in health and disease // Progr. Food and Nutr. sci.- 1975.-V. 21, N l.-P. 64.

170. Himanen J.-P., Pyhala L., Olander R.-M. et al. Biological activites of lipo-teichoic acid and peptidoglycan teichoic acid of Bacillus subtilis 168 // J. Gen. Microbiol. - 1993.-V. 139,N 11.-P. 2659-2665.

171. Hirano Y., Matsudo M., Kameyama T. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of proteins synthesized during early germination of Bacillus subtilis 168 in the presence of actinomycin D // J. Basic Microbiol. 1991. - V. 31, N 6.- P. 429-436.

172. Humbert Florence Les probiotigues: un sujet d" actualite //Bull. inf. Stat. exp. auicult. Ploufragan. 1988. - V. 28, N 3. - P. 128-130.

173. Inouye S., Kondo S. Amicoumacin and SF-2370, pharmacologically active agents of microbiol origin // Novel Microbial Prod. Med. and Agr. Amsterdam. -1989.-P. 179-193.

174. Johnson С. E. Lethal toxin of Bacillus cereus 1. Relationships and nature of toxin, hemolysin and phospholipase // J. Bacterid. 1967. V. 94, N 2. - P. 306316.

175. Kakinuma A., Hori M., Isono M. Determination of fatty acid in surfactin and elucidation of the total structure of surfactin // Agric. and Biol. Chem. 1969. - V. 33. - P. 973-976.

176. Kaneko J., Matsushima H. Crystal-like structure in the sporulation cells of Bacillus subtilis 168 // J. Electron. Microsc.- 1973. V. 22, N 2. - P. 217-219.

177. Kaneko J., Matsushima H. Crystalline inclusions in sporulating Bacillus subtilis cells // In: Spores YI. Select. Pap. 6th Int. Spore Conf. Washington. - 1975. -P. 580-585.

178. Kitazawa H., Nomura M., Itoh T. J Dairy Sci 1991; 74: 7: 2082 2088.

179. Kubo Kazuhiro. Pure culture of Bacillus subtilis FERM BP-3418 // Пат. N 5364738. США. МКИ A01N 25//00. - публ. 15.11.94.

180. Kudrya V.A., Simonenko L.A. Alkaline serine proteinase and lectine isolation from the culture fluid of Bacillus subtilis // Appl. Microbiol, and Biotechnol. -1994.-V. 41,N5.-P. 505-509.

181. Le H., Anagnostopoulos C. Detection and characterization of naturally occur-ing plasmids //Molec. Gen. Genet. 1977. - V. 157. - P. 167-174.

182. Legakis N.J., Papavassilion J. Thin-layer chromatographic technique for rapid detection of bacterial phospholipases // J. Clin. Microbiol.- 1975. V.2, N 5. - P. 373-376.

183. Leviveld H.L.M., Bachmayer H., Boon B. et al. Safe biotechnology. Part 6. Safety assessment, in respect of human health of microorganisms used in biotechnology // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1995. V. 43, N 3. - P. 389-393.

184. Lin S.-C., Carswell K.S., Sharma M.M., Georgiou G. Continuos production of the lipopeptide biosurfactant of Bacillus licheniformis JF-2 // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1994. - V. 41, N 3. - P. 281-285.

185. Lovett P., Bramucci M. Plasmid DNA in bacilli // In: Microbiology- Washington. 1976. - P. 388-393.

186. Markham R., Wilkie B. Influence of detergent on aerosol allergic sensitization with enzymes of Вас. subtilis // Int. Arch. Allergy and Appl. Immunol. 1976. -V. 51, N 5. - P. 529-543.

187. Maruta Kiyoshi Exclusion of intestinal pahogens by continuous feeding with Bacillus subtilis C-3102 and its influence on the in testinal microflora in broilers // Anim. Sci. and Technol. 1996. - V. 67, N 3. - P. 273-280.

188. Moszer I., Glaser P., Danchin A. SubtiList: A relational database for the Bacillus subtilis genome // Microbiology. 1995. - V. 141, N 2. - P. 261-268.

189. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Jolken R.H., Manual of Clinical Microbiology, 7th Edition, Washington D.C., ASM Press, 1999

190. Nozari-Renard J. Induction d 5, OInterferon par Bacillus subtilis // Ann. Microbiol. 1978. - V. 129a. - N 4. - P. 525-542.

191. Oh M.K., Kim B.G., Park S.H. Importance of spore mutants for fed-batch and continuous fermentation of Bacillus subtilis // Biotechnol. and Bioeng. 1995. -V. 47, N 6. - P. 696-702.

192. Payne Jewel M. Isolates of Bacillus thuringiensis Hist are active ayanist nematodes / Патент N 5151363, C12 N 1/20, A 01 N 63/00, заявл. 27.07.90., опубл. 29.09.92.

193. Pepys J., Hargreave F., Longbotton Y. Allergic reactions of the lungs to enzymes of Bacillus subtilis // Lancet. 1969. - V. 1, N 44 - 7607. - P. 1181-1184.

194. Peterson W.L., Mackrowiak Ph.A., Barnett C.C. et al. The human gastric bactericidal barrier: Mechanisms of action, relative antibacterial activity, and dietary influences.//J. Infec. Diseases. -1989. -159 № 5. -p.978-985.

195. Prasad S.S.V., Shethna G.J. Biochemistry biological activities of the proteina-ceous crystal of Bacillus thuringiensis // J. Sci. and Ind. Res. 1976. - V. 35, N 10. - P. 626-632.

196. Rocchietta I. The use of Bacillus subtilis in the treatment of the diseases/Minerva Med. -1969. -60. N3/4. -P. 117-123.

197. Rosental G.J., Corsini E. // Methods Immunotoxicol. 1995. V 1, P 327-343

198. Rychen G., Simoes Nunes C. Effets des flores lactigues des produits laitiers fermentes: Une base scientifigue pour l"etude des probiotiques microbiens dans l"espece porcine // Prod. anim. 1995. - V. 8, N 2. - C. 97-104.

199. Salminen Seppo Clinical aspects of probiotics //Ecol. health and Disease.-1999.- 11.-N4.-P. 251-252

200. Shore N., Greene R., Kezeni H. Lung disfuction in worcers exposed to Bacillus subtilis // Environm. Res. 1971. - V. 4, N 6. - P. 512-519.

201. Slein M., Logan G., Characterization of the phospholipases of Вас. cereus and their effects on erytrocytes, bone and kidnei cells // J. Bacteriol. 1965. - V. 90, Nl.-P. 69-81.

202. Somerville H.J. The insecticidal endotoxin of Bacillus thuringiensis // In: Sem. etude theme Prod, natur. et prot. plant. 1977. - P. 253-268.

203. Spira W., Goepfert J. Biological characteristics of an enterotoxin produced by Bacillus cereus // Can. J. Microbiol. 1975. - V. 21, N 8. - P. 1236-1246.

204. Stgard Henri Microbielle v kstfremmer til svin. Teori og prasksis/ Dan veterinaertidsskr. 1989. - V. 72, N 15. - P. 855-864.

205. Su Li, Zhang Zhihong, Xiao Xianzhi, Wang Xiaomin Wuhan daxue xuebao. Ziran kexue ban // J. Wuhan Univ. Natur. Sci. Ed. 1996. - V. 42, N 4. - C. 516518.

206. Sumi H. Physiological function of natto // J. Brew. Soc. Jap. 1990. - V. 85, N 8.-P. 518-524.

207. Tihole F. Fizioloski pomer backteriemije z geiunalo microflora // Zdravstv vestn 1982. - V. 51, N 1. P. 3-5.

208. Towalski Z., Rothman H. Enzyme technology //in: The Biotechnological Challenge. Cambridge University Press. Cambridge, 1986 - P. 37 -76.

209. Tsuge Kenji, Ano Takashi, Shoda Macoto. Characterization of Bacillus subtilis YB8, coproducer of lipopeptides surfactin and plipastatin B1 //J. Gen. and Appl. Microbiol. 1995.- 41, N 6. P. 541-545.

210. Van der Waaij D. Colonization resistance of the digestive tract: mechanism and clinical consequences.//Nahrung. -1987. -31 № 5. -p.507-524.

211. Vollaard E.J., Clasener H.A.L., Janssen J.H.M. The contribution of Escherichia coli to microbial colonization resistance.//.!, of Antimicrobial Chemotherapy. -1990.- 26. -p.411-418